染色體異常、染色體多態性與睪丸生精障礙的相關性分析

李秀蘭 莫小東 唐 莉 魏海云

1.東莞市人民醫院產前診斷中心(廣東東莞 523000);2.東莞市人民醫院生殖醫學科(廣東東莞 523000)

前 言

根據世界衛生組織報道顯示,在適齡夫婦中有約15%的人群存在不育,其中超過50%是由男性因素導致[1]。 我國相關文獻顯示,適齡夫婦不育的發生率為10% ～20%,因其發病率逐年升高而受到廣大學者的密切關注[2]。 導致男性生殖系統功能障礙多為先天性發育異常,如睪丸發育不全等,后天因素生殖系統感染等等。 近些年,逐漸發現染色體異常是導致男性生殖功能障礙的主要原因,與正常男性相比,睪丸生精障礙的患者染色體異常主要表現為Y 染色體無精子因子(Azoospermia factor,AZF)微缺失,且發生率明顯升高[3]。 相關研究顯示,少精子癥和無精子癥中發生染色體異常的概率分別為4.6%和13.7%,通常存在染色體數目及結構異常,數目變化常表現為三體、三倍體及X 單體,結構異常為染色體斷裂、倒置及缺失[4]。 隨著染色體顯帶技術發展,對染色體形態及結構有了全新的認知,一種涉及染色體結構、寬窄及著色的微小恒定變異引起了人們的關注,被稱為染色體多態性[5]。 染色體多態性廣泛存在健康人群中,但是不會誘發疾病,屬于一種正常變異。 但越來越多的學者研究證實,染色體多態性與生殖疾病存在關聯,染色體多態性的男性精子非整倍概率增加,臨床通常診斷結果為少精子或無精子,患者存在生育障礙,但是觀點尚未得到統一,還需要進一步研究[6]。 本文通過收集我院295 例睪丸生精障礙患者進行染色體核型分析及性激素檢查來探討其相關性及影響。

一、資料與方法

(一)一般資料

收集2020 年4 月～2021 年5 月經本院生殖醫學科診斷為睪丸生精障礙的295 例患者作為研究對象。 年齡23 歲～45 歲,平均年齡34 歲,少精子癥178 例,無精子癥為117 例。 納入患者均符合WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》診斷,包含患者至少連續進行2 次以上的常規檢查,后經離心均未發現精子為無精子癥,精子密度＜15×106/mL 為少精子癥。 所有患者均排除睪丸損傷、睪丸腫瘤以及其他因梗阻導致無精子癥等非睪丸生精障礙患者。

(二)染色體G 顯帶核型分析

所有患者采用5mL 無菌注射器,于肘部抽取1mL靜脈血,分別在2 個培養瓶中接種血液0.5mL,加入20μL ～40μL 的植物血球凝集素(Phytohaemagglutinin,PHA)液體,培養瓶瓶口采用酒精灼燒,輕輕搖晃放入培養箱,72h 后加入4μg/mL 的0.05mL 的秋水仙素,培養6h。 制備染色體標本,終止培養后進行離心沉淀,離棄上清液后加入7mL 的低滲液,1000r/min 離心6min,制備細胞懸液,滴在載玻片上后用口吹氣,后利用酒精燈烘烤,再室溫環境中存放3d 后可用來顯色。 染色體G 顯帶胰蛋白酶配制,25mL 的生理鹽水和25mL 的0.02% 的乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)導入立式染色缸內,加入2.5%胰蛋白酶1mL,滴入2 滴氫氧化鈉調整pH 值為7.0 ～7.2,后放到37℃水浴箱中預熱。 沖洗2 次,Giemsa 染色5 ～10min(37℃),過程中將G 顯帶染色體標本鏡檢,核型3 ～5個,異常者計數50 個細胞,分析10 個核型。

(三)血清中性激素檢測

采集靜脈血2mL,3500r/min 分離10min 采用購自BECKMAN COULTER 化學發光法試劑盒,按照試劑盒說明書檢測血清中血清催乳素(Prolactin,PRL)(正常參考 值: 55. 97 ～278. 36mIU/mL)、 黃 體 生 成 素(luteinizing hormone, LH) (正常參考值: 1. 24 ～8.62mIU/mL)、 促 卵 泡 生 成 素( Follicle-stimulating hormone,FSH)(正常參考值:1.27 ～19.26mIU/mL)、睪酮(testosterone,T)(正常參考值:2.6 ～13.2nmol/L)。

(四)統計學分析

采用SPSS 23.0 統計學分析,計量資料性激素采用(X±S)表示,組間比較采用t檢驗或單因素方差分析,計數資料采用n(%)表示,組間比較行卡方檢驗或費舍爾精確經驗,以P＜0.05 為差異有統計學意義。

二、結果

(一)染色體核型異常的檢出率

本研究選入的睪丸生精障礙的295 例,染色體異常為75 例(21.13%),少精子癥178 例中染色體異常為35 例(19.66%),無精子癥為117 例,其中染色體異常為40 例(34.19%),比較有統計學意義(X2=7.856,P=0.005)。 295例患者中染色體多態性為71 例(24.07%),少精子癥178例中染色體多態性為34 例(19.10%),無精子癥為117例其中染色體多態性為37 例(31.62%),比較有統計學意義(X2=6.597,P=0.010),見圖1。

圖1 各組患者染色體異常及染色體多態性比較

(二)無精子癥及少精子癥患者的染色體核型異常分析

少精子癥患者的染色體核型異常主要表現為平衡易位為10 例(28. 57%),次要表現為臂間倒位6 例(17.14%),無精子癥患者的染色體核型異常主要表現為克氏征為主為28 例(70.00%),具體不育患者核型異常情況見表1。

表1 無精子癥及少精子癥患者的染色體核型異常分析

(三)無精子癥及少精子癥患者的染色體多態性分析

本文無精子癥及少精子癥患者的染色體多態性主要包含小Y 長臂次縊痕增加(qh+)、隨體多態性(ps+/ps-)、大Y、小Y 及9 號染色體倒位。 無精子癥中Y 染色體多態性包含46,XY,小Y 及46,XY,大Y 為25 例(67. 57%),少精子癥患者的占據25例(73.53%)。 無精子癥患者的小Y 長臂次縊痕增加4 例(10.81%)、少精子癥患者為2 例(5.88%),無精子癥患者隨體多態性為4 例(10. 81%),少精子癥患者為2 例(5.88%),無精子癥患者9 號染色體倒位為4 例(10. 81%),少精子癥患者為5 例(14.71%),見表2。

表2 無精子癥及少精子癥患者的染色體多態性分析

(四)無精子癥及少精子癥染色體核型異常患者與血清性激素水平比較

與少精子癥相比,無精子癥患者染色體核型異常的血清中FSH、LH 升高,T 水平降低(P＜0.05),見表3。

表3 染色體核型異常與血清性激素水平比較

(五)無精子癥及少精子癥染色體多態性與血清性激素水平比較

與少精子癥染色體多態性患者相比,無精子癥合并染色體多態性的患者血清中FSH、LH 升高,T 水平降低(P＜0.05),見表4。

表4 染色體多態性與血清性激素水平比較

三、討論

當前,男性生育功能障礙顯著提高,約有30%的男性患者存在不育,嚴重影響患者生活質量。 目前已知引起男性睪丸生精障礙的因素較多,其中染色體異常是導致男性不育的主要原因。 相關國內報道數據證實我國不育男性41.70%的患者存在染色體異常[7]。 在男性生精障礙患者存在染色體核型異常及染色體多態性異常,目前,采用ICSI 技術雖然能夠改變個別無精子患者不育的結局,但是對子代存在高遺傳性的風險,因此提高染色體異常檢出對于提高患者生育能力有重要作用。 本文通過觀察對睪丸生精障礙的患者進行染色體核型分析,了解是否存在染色體異常或者染色體多態性,希望有助提高臨床治療針對性而增加臨床療效。

本文研究證實,在295 例睪丸生精障礙的患者中無精子癥有34.19%患者存在染色體異常,少精子癥患者有19.66%患者存在染色體異常。 無精子癥患者染色體異常主要以克氏征為主,少精子癥染色體異常主要以平衡易位及臂間倒位為主[8]。 劉興章等[9]研究表示,在299 例睪丸生精障礙患者中無精子癥患者中染色體核型異常的概率為34. 50%,少精子癥中概率為13.00%,均說明染色體數目或結構異常可導致男性患者不育,本文結果與之相似。 無精子癥染色體核型異常主要表現在47,XXY 即克氏征,是由染色體數目異常導致是導致患者原發性睪丸功能障礙的主要原因[10]。該類患者臨床癥狀主要表現在睪丸小而硬,組織學上表現為睪丸曲細精管纖維化和透明樣變,管腔閉塞而無精子生成,是導致無精子癥主要原因[11]。 少精子癥患者染色體異常主要以染色體相互異位為主,可誘發精子改變程度與配子染色體產生重復或缺失。 染色體核型臂間倒位在少精子癥患者中檢出率較高,主要由染色體倒位形成,產生不成熟的精子而導致精子減少。

染色體多態性主要是指染色體微小形態的改變,人類染色體多態性主要集中在Y 染色體長臂遠端、隨體及次縊痕等[12]。 Y 染色體形態改變主要表現為大Y及小Y 改變。 大Y 改變會導致Y 染色體中基因片段重疊性升高,導致有絲分裂增加,影響精子細胞分化及發育。 小Y 改變主要表示Y 染色體中遺傳物質缺失。 以往多數研究表示,睪丸生殖功能障礙中患者中Y 染色體缺失可導致無精子或少精子[13-14]。 小Y 缺失可控制精子發育基因而影響睪丸發育而導致無精子或少精子。 朱紅芬[15]研究顯示,無精子癥患者中46,XY(大Y)染色體數目正常,但是Yq12 增長是長臂次縊痕增加所致,可導致精子細胞異常或死亡,誘發無精子癥產生,Y 染色體攜帶者生成異常精子的原因可能是:大Y染色體長臂遠端的異染色質主要是串聯重復序列,造成有絲分裂錯誤,使基因調節及細胞分化的過程紊亂,從而直接影響男性生殖細胞的形成。 9 號染色體倒位在睪丸生精障礙患者中發病率較低,該類患者無遺傳物質丟失,但是可導致精子生成基因順序顛倒,影響精子生成。 本文研究證實,在無精子癥患者中有31.62%患者染色體多態性。 少精子癥患者中有19.10%患者存在染色體多態性。 無精子癥及少精子癥患者均表現為Y 染色體多態性,分別占67.57%及73.53%,還表現為小Y 長臂次縊痕、隨體多態性及9 號染色體倒位等。這與Li 等[16]研究結果相似。

正常情況下細胞分泌抑制素能夠降低FSH 釋放而維持正常水平,但是當細胞-曲細精管復合體損傷時會降低抑制素水平,導致FSH 水平升高,LH 受到刺激或可調節睪丸間質細胞中T 表達[17]。 胡皓睿[18]研究表示,睪丸功能性問題的主要原因是支持細胞-曲細精管復合受損,負反饋作用下引起FSH、LH 分泌的增加,隨即抑制睪酮T 的分泌,進而直接影響患者生育能力,因此通過檢測血清中性激素水平有利于了解患者睪丸功能,為臨床治療提供依據。 睪丸生精障礙患者病變部位主要在睪丸,這時細胞-曲細精管復合體存在損傷而導致性激素水平改變,會進一步影響精子密度[19]。 本文研究表示,與少精子癥患者相比,無精子癥患者FSH、LH 升高,T 水平降低,說明無精子癥患者的細胞-曲細精管復合體損傷加重可影響精子產生,甚至無精子產生。 47,XXY是中X 染色體增加會對睪丸產生影響,多余的X 染色體抑制了Y 染色體的正常功能,導致性征發育不良及曲細精管玻璃樣變性,間質細胞增生,無精子生成而不育[20]。 本文研究表示,與少精子癥染色體多態性患者相比,在無精子癥染色體多態性異常患者中的FSH、LH 升高,T 水平降低,這與林靜[21]結果相似。 與少精子癥相比,無精子癥患者中Y染色體多態性表現為Y 染色體多態性表現為患者血清中呈現高水平的FSH,LH 表達,T 表達降低,推測無精癥患者血清FSH、LH 的升高時極有可能出現染色體結構異常及Y 染色體片段改變,建議進行外周血染色體的檢查。

綜上所述:男性睪丸生精障礙患者存在染色體異常概率明顯高于正常男性,其中核型異常以克氏征(47,XXY)較常見,與無精子癥患者相比,少精子癥患者血清中FSH、LH 降低,T 較高,可作為檢測男性患者睪丸生精障礙指標并與染色體異常相關,具體機制值得深入研究。