組蛋白去乙酰化酶1對非酒精性脂肪性肝病細胞模型胰島素抵抗的影響

朱 恒， 孔維宗， 黃貴群， 白 昱， 王迎春

1 大連大學附屬中山醫院 消化二科， 遼寧 大連 116001； 2 大連大學 中山臨床學院， 遼寧 大連 116001

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是我國第一大慢性肝病，臨床上無特異表現，通常表現為營養過剩和代謝綜合征相關癥狀[1-2]。NAFLD的發病機制目前最經典的假說仍是Day和James[3]提出的“二次打擊”學說，其理論核心在于首次打擊的胰島素抵抗(IR)。組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDAC)與組蛋白乙酰基轉移酶拮抗修飾染色體各區段組蛋白的乙酰化程度，是基因表達調控的主要方法[4-5]。目前已知HDAC1為抗腫瘤治療提供了靶點[6]，但對NAFLD發病的影響尚不明確。因此，本實驗在細胞水平上研究HDAC1在NAFLD病變過程中對IR的影響，明確可能存在的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 HepG2細胞(大連理工大學細胞庫)；油酸(OA)[生工生物工程(上海)股份有限公司]；牛血清白蛋白(BSA-V，不含脂肪酸)、油紅O染色試劑盒、ECL超敏發光液(索萊寶)；CCK-8檢測試劑盒(DOJINDO)；一步法RT-qPCR試劑盒、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量試劑盒(凱基生物)；Pyroxamide、HDAC1一抗、胰島素受體底物-1(IRS-1)一抗(Abcam)；Prestained Protein Ladder、HRP標記羊抗兔IgG(ThermoFisher)、β-Actin抗體(巴傲得生物)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 實驗將HepG2細胞于含10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗的DMEM高糖培養基中進行培養，置于37 ℃、5% CO2培養箱中，至細胞融合率達80%～90%時加入0.25%胰蛋白酶消化細胞，按1∶3比例進行傳代及后續操作。

1.2.2 HepG2細胞增殖活力評估 采取CCK-8法，將對數生長期的HepG2細胞按梯度為0.1×104、0.2×104、0.5×104、1×104個，100 μL每孔的密度分別接種至96孔培養板上，每組細胞各設4個復孔。依次待24 h、48 h、72 h后，向各孔內加10 μL CCK-8溶液，繼續培養2 h后，在酶標儀上以波長450 nm檢測各孔光密度(OD)值。以橫軸為細胞數目，縱軸為OD值，生成細胞標準生長曲線。

1.2.3 OA和Pyroxamide濃度篩選 采取CCK-8法，將對數生長期的HepG2細胞計數至0.5×104個，按每孔100 μL的密度接種于96孔培養板上，每組細胞各設4個復孔。細胞貼壁后，依次添加濃度梯度為0、0.125 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L的OA和濃度梯度為0、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L的Pyroxamide繼續培養24 h，向各孔內加10 μL的CCK-8溶液，繼續培養2 h后，在酶標儀上以波長450 nm檢測各孔OD值。

1.2.4 細胞分組 將HepG2細胞分為對照組、模型組和抑制劑組，對照組細胞用DMEM高糖培養基進行培養；模型組細胞用含OA(篩選出的最佳濃度)的DMEM培養基誘導24 h；抑制劑組細胞先用含0.25 mmol/L OA的DMEM培養基誘導24 h，再用加入含Pyroxamide(篩選出的最佳濃度)的DMEM培養基作用24 h。

1.2.5 NAFLD模型驗證

1.2.5.1 細胞脂肪變程度檢測 將處理過的HepG2細胞以3×105/mL的密度接種于6孔板上，PBS緩沖液沖洗2次，加油紅O固定液室溫固定30 min；水洗2次浸入60%異丙醇5 min；加入油紅O染液，37 ℃避光染色40 min；蘇木素染色液復染核2 min，加入緩沖液1 min，以蒸餾水覆蓋細胞并于顯微鏡下觀測細胞內的脂滴蓄積程度；60%異丙醇溶解15 min后移至96孔板中，在酶標儀上以波長510 nm檢測各孔OD值。

1.2.5.2 常規生化指標檢測 將處理過的HepG2細胞以3×105/mL的密度接種于6孔板上，提取細胞上清液，全自動生化儀檢測細胞內ALT、AST、TG、TC的含量。

1.2.6 RT-qPCR法檢測HDAC1、IRS-1 mRNA的表達 采用RT-qPCR法，提取各組HepG2細胞的總RNA，測定RNA純度，定量分析后逆轉錄合成cDNA第一鏈，引物序列見表1，進行PCR。逆轉錄反應條件為：45 ℃ 15 min，94 ℃ 2 min。PCR反應條件為：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 kb/min，35個循環，72 ℃ 5 min。以β-Actin為對照，計算各組別的CT值，用2-△△Ct法分析目的基因的相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.7 Western Blot法檢測HDAC1、IRS-1蛋白的表達

利用Western Blot法，取處理后的HepG2細胞，用全蛋白提取試劑盒提取各組細胞的總蛋白；BCA法對蛋白進行定量分析后將蛋白樣品加到泳道上，以140 V恒壓電泳90 min；電泳結束后，將樣品與PVDF膜放入轉印槽中，以80 V恒壓、冰浴條件下進行電轉60～120 min；轉膜后，將PVDF膜置于封閉液中室溫封閉1 h，洗膜加一抗4 ℃孵育過夜；洗膜加二抗室溫搖床孵育1 h；再次洗膜后加入配好的顯色液，室溫下與PVDF膜避光反應3 min，進行曝光拍照。

2 結果

2.1 HepG2細胞標準生長曲線 HepG2細胞的不同接種濃度和接種時間對實驗后續結果的影響不同，通過繪制細胞標準生長曲線可以篩選出實驗最佳的細胞接種濃度和時間范圍。HepG2細胞標準生長曲線見圖1。通過曲線可知，當細胞密度范圍在0.2×104～0.5×104/孔時，HepG2細胞在96孔板中培養48 h的曲線斜率最明顯，即處于細胞對數生長期，細胞營養充足，活力良好，增殖速度穩定，適宜用于后續實驗。

圖1 HepG2細胞標準生長曲線

2.2 OA造模條件的確立 檢測不同濃度的OA誘導HepG2細胞24 h后的細胞活性，結果顯示，OA濃度在0～0.25 mmol/L范圍內對細胞活性并無顯著影響，與0 mmol/L組相比，差異均無統計學意義(P值均>0.05)。當OA濃度大于0.25 mmol/L時明顯抑制了細胞活性，與0 mmol/L組相比，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表2)。

2.3 HDAC1抑制劑Pyroxamide濃度篩選 通過測定不同濃度HDAC1抑制劑Pyroxamide培養HepG2細胞24 h后的細胞增殖活力結果顯示，濃度在0～20 μmol/L范圍內Pyroxamide對細胞增殖活力沒有明顯影響，各濃度Pyroxamide組與0 μmol/L組相比，差異均無統計學意義(P值均>0.05)。Pyroxamide濃度達到25 μmol/L時，細胞生長明顯受到抑制，與0 μmol/L組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。因此，選擇濃度為20 μmol/L的Pyroxamide為最佳給藥濃度(表3)。

表2 不同濃度OA對HepG2細胞活性的影響Table 2 Effects of different concentrations of oleic acid on the activity of HepG2 cells

表3 不同濃度Pyroxamide對HepG2細胞增殖活力的影響Table 3 Effects of different concentrations of Pyroxamide on the proliferation activity of HepG2 cells

2.4 NAFLD模型驗證

2.4.1 細胞脂肪變程度檢測 油紅O染色后可見，對照組細胞形態飽滿，邊界清晰，胞核呈藍色，胞內鮮見脂滴；模型組細胞邊界模糊，胞內沉積有大量橘紅色脂滴，并環形圍繞于胞核周圍；抑制劑組細胞經20 μmol/L的Pyroxamide處理后胞內橘紅色脂滴數量明顯少于模型組(圖2)。模型組細胞OD值較對照組明顯升高，而抑制劑組細胞OD值較模型組顯著降低(P值均<0.05)(表4)。結果表明，濃度為0.25 mmol/L的OA成功誘導HepG2細胞構建了NAFLD模型，同時濃度為20 μmol/L的Pyroxamide有效緩解了細胞內脂滴蓄積。

對照組

模型組

抑制劑組圖2 各組別細胞內脂滴蓄積程度(油紅O染色，×40)Figure 2 The accumulation of lipid droplets in cells in each group (Oil red O staining, ×40)

表4 細胞脂肪變程度比較Table 4 Comparison of the degree of cellular steatosis

2.4.2 生化指標檢測 收集各組細胞上清液檢測發現，各組細胞ALT、AST、TG、TC含量均不相同：模型組相比于對照組ALT、AST、TG、TC含量均升高，而抑制劑組相比于模型組ALT、AST、TG、TC含量均降低，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表5)。

2.5 RT-qPCR法檢測HDAC1、IRS-1 mRNA的表達 RT-qPCR法檢測3組細胞HDAC1、IRS-1 mRNA表達，結果顯示：與對照組相比，模型組HDAC1 mRNA表達量明顯升高，IRS-1 mRNA表達量卻顯著下降(P值均<0.05)；加用Pyroxamide后，與模型組相比，抑制劑組HDAC1 mRNA表達量下降，IRS-1 mRNA表達量升高，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表6)。

表6 各組HDAC1、IRS-1 mRNA表達量比較Table 6 Comparison of HDAC1 and IRS-1 mRNA expression in each group

2.6 Western Blot法檢測HDAC1、IRS-1蛋白的表達 Western Blot法檢測3組細胞HDAC1、IRS-1蛋白表達，結果顯示：與對照組相比，模型組HDAC1蛋白表達量明顯升高，IRS-1蛋白表達量顯著下降(P值均<0.05)；加用Pyroxamide后，與模型組相比，抑制劑組HDAC1蛋白表達量明顯下降，IRS-1蛋白表達量顯著升高(P值均<0.05)(表7，圖3)。

表7 各組HDAC1、IRS-1蛋白表達量比較Table 7 Comparison of HDAC1 and IRS-1 protein expression in each group

圖3 各組別細胞內HDAC1、IRS-1蛋白的表達Figure 3 Expression of HDAC1 and IRS-1 proteins in cells of each group

表5 各組生化指標比較Table 5 Comparison of biochemical indicators in each group

3 討論

本實驗篩選后選用對細胞活性無明顯影響的0.25 mmol/L的OA濃度處理HepG2細胞并進行油紅O染色，結果顯示模型組細胞內沉積大量脂滴，且細胞未發生裂解死亡，說明0.25 mmol/L的OA能夠使HepG2細胞發生脂肪變。OA具有直接細胞毒性，可使細胞發生壞死炎癥，同時作為游離脂肪酸的一種，OA可透過細胞膜，產生大量的TG，因此常規生化檢測ALT、AST、TC、TG含量模型組顯著高于對照組，表明經過OA誘導，HepG2細胞的膜通透性增加，肝酶外溢隨之增加，與此同時游離脂肪酸攝入增加，細胞內部產生TG、TC的能力也提高，再次證明0.25 mmol/L的OA濃度誘導HepG2細胞成功建立了NAFLD細胞模型。

表觀遺傳學是在不改變DNA序列的前提下改變基因的表達，并且部分基因改變可以遺傳。現有研究證實表觀遺傳學參與調控IR、脂質代謝、氧化應激和炎癥反應等，組蛋白修飾正是其重要的分子調控機制之一。高脂引發的NAFLD與組蛋白修飾密切相關，其中HDAC1是組蛋白去乙酰化調控的重要元件之一[7]。本實驗首先檢測了對照組和模型組細胞HDAC1 mRNA及蛋白的表達量，與對照組相比，模型組細胞中HDAC1 mRNA和蛋白表達量明顯增加，這說明HDAC1在NAFLD細胞模型中表達上調，驗證HDAC1的確參與了NAFLD的發生與發展，并且起到了促進作用，這與之前郭云蔚等[8]在一項對高脂飲食小鼠的研究中發現HDAC1參與了脂肪肝的形成的結果不謀而合。但是有關HDAC1調控NAFLD發生的具體機制尚無明確定論，因此，實驗進一步探討HDAC1影響肝臟脂肪變可能存在的分子靶點。

本實驗認為，組蛋白修飾調控脂質代謝和糖代謝，當HDAC1過度表達時即會導致肝臟脂肪變和IR，進一步發展為NAFLD[9]。IRS-1是胰島素受體底物最經典的成員，在胰島素作用的外周組織中廣泛表達，通過控制胰島素信息的傳遞，對機體代謝發揮作用[10]。IRS-1表達缺失或磷酸化異常均會阻礙下游胰島素信號轉導，導致IR[11]。所以本實驗猜想HDAC1與IRS-1或許在調節IR導致的NAFLD病程中具有某種聯系。因此，實驗再次檢測對照組和模型組細胞IRS-1 mRNA及蛋白的表達量，結果正與HDAC1表達量相反，與對照組相比，模型組細胞中IRS-1 mRNA和蛋白表達量明顯降低。這說明在NAFLD發生過程中，HDAC1表達上調，而IRS-1的表達受到了抑制，但是單純的NAFLD模型并不能解釋IRS-1表達被抑制是否受到了HDAC1的調控，因此實驗在模型組的基礎上，選取選擇性HDAC1抑制劑Pyroxamide設置抑制劑組來驗證上述假設。

本實驗選取HDAC1高選擇性抑制劑Pyroxamide作用于已經建立成功的NAFLD模型細胞，經驗證濃度為20 μmol/L的Pyroxamide為抑制HDAC1表達且不影響細胞增殖活力的最佳給藥濃度。再次檢測并比較對照組、模型組和抑制劑組之間HDAC1和IRS-1 mRNA及蛋白表達量，結果恰如假設，各組細胞內HDAC1 mRNA和蛋白表達量比較，模型組高于對照組，抑制劑組低于模型組，各組細胞內IRS-1 mRNA和蛋白表達量比較，模型組低于對照組，抑制劑組高于模型組。該結果很大程度上表明HDAC1調節IR參與NAFLD發生的分子靶點之一在于IRS-1。既往研究[12]表明，HDAC1參與的去乙酰化修飾屬于組蛋白修飾的一種重要方式，HDAC1表達增加會導致組蛋白H3第4位、第9位等不同重要區域賴氨酸乙酰化水平降低，使得靶基因與轉錄因子的結合位點無法識別，降低基因轉錄。因此，HDAC1可能是通過調控組蛋白賴氨酸乙酰化水平影響了IRS-1與胰島素信號的結合，降低IRS-1的轉錄，使其表達減少，但是HDAC1作用的具體組蛋白結合區域還需要進一步實驗驗證。結合Khan等[13]在T2DM小鼠中發現丁酸鈉通過抑制HDAC抑制了IR，改善了肝臟脂肪變和其另一項實驗[14]發現丙戊酸也可以通過抑制HDAC抑制IR和脂質沉積的研究結果，本實驗認為，HDAC1增加抑制了IRS-1的表達，進而抑制了下游胰島素信號的傳導，導致IR，參與NAFLD的發生與發展；同時，HDAC1選擇性抑制劑Pyroxamide抑制HDAC1后恢復了IRS-1的表達，緩解了肝臟脂肪變，或對肝臟起到保護作用。

僅有少量肝病領域研究證實HDAC1參與了NAFLD的發生且機制未明。因此，本研究驗證了此觀點并且討論了HDAC1可以通過抑制IRS-1分子表達來抑制葡萄糖的吸收，促進IR，參與了NAFLD的發生發展；同時，HDAC1抑制劑Pyroxamide可以上調IRS-1表達，改善NAFLD，也證實了假設。但是HDAC1調控IRS-1表達的具體組蛋白結合域和抑制IRS-1介導的具體胰島素信號通路尚待進一步討論，同時Pyroxamide的抑制作用僅在體外模型中驗證，未來仍需繼續利用動物模型來研究其對NAFLD的治療效果。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：朱恒負責實驗操作，結果分析，起草和修改論文；孔維宗、黃貴群負責實驗操作，數據分析；白昱負責收集和整理課題資料，分析數據；王迎春負責課題設計，擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。