SMAD7 在多發性骨髓瘤中的表達及對細胞增殖和耐藥的影響

丁 賀，曹楊琳，何 楊，魏 星，楊劍峰

1.蘇州大學蘇州醫學院唐仲英醫學研究院血液學研究中心，蘇州 215123；2.蘇州大學附屬第一醫院江蘇省血液研究所，蘇州 215006；3.蘇州大學附屬第一醫院消化內科，蘇州 215006

臨床上，多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）常表現為惡性漿細胞在骨髓中的克隆性增生，是僅次于非霍奇金淋巴瘤的第二常見的血液系統惡性腫瘤［1］。大多數MM患者的異常漿細胞可表達單克隆免疫球蛋白（也稱M 蛋白）。研究［2］顯示，MM 可損害相關終末器官，導致高鈣血癥、腎功能不全、貧血和骨質破壞等。近20年來，自體造血干細胞移植、新型治療藥物的開發以及CAR-T細胞治療、雙特異抗體等新興免疫療法的應用已顯著改善了MM患者的治療效果，但由于其耐藥、復發等因素使得絕大多數患者仍不能完全被治愈［3-6］。因此，繼續深入探索MM的發病機制及其新的治療策略是臨床亟待解決的一大問題。

Sma 和Mad 相 關 蛋 白7 （Sma- and Mad-related protein 7，SMAD7）是轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路的重要抑制性分子，在多種實體瘤（如胃癌、乳腺癌、鱗狀細胞癌等）中參與腫瘤的生長、轉移、耐藥等［7-9］。目前，SMAD7 在MM 中的表達及在骨髓瘤發生發展中的生物學功能尚未被研究報道。基于此，本研究結合生物信息學分析，檢測健康捐獻者和MM 患者的骨髓CD138+細胞中SMAD7mRNA的相對表達，并通過體外功能實驗驗證SMAD7 對MM 細胞增殖、耐藥的影響，從而為MM的靶向治療提供一定的理論基礎。

1 資料與方法

1.1 數據收集及分析

從基因表達綜合（gene expression omnibus，GEO）數據庫中下載MM數據集GSE5900、GSE6477、GSE13591。GSE5900 數據集包含22 例健康捐獻者、44 例意義未明單克隆丙種球蛋白血癥（monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS） 和12 例冒煙型骨髓瘤（smoldering myeloma，SMM）的數據，分析SMAD7在健康捐獻者和進展為MM的2個前期階段（即MGUS、SMM） 中的表達差異。GSE6477數據集包含15例健康捐獻者、22例MGUS、24例SMM和73例新診斷MM的數據，分析SMAD7在該病例中的差異表達。GSE13591數據集包含5例健康捐獻者、11例MGUS、133例MM和9例漿細胞白血病（plasma cell leukemia，PCL）的數據，分析SMAD7在該病例中的差異表達。GEO數據庫提取的SMAD7表達數據均采用R4.0.1軟件進行分析。

1.2 標本收集、臨床資料獲取及分析

選擇2021年6月—2022年3月于蘇州大學附屬第一醫院血液科的8例健康捐獻者和20例MM患者。收集健康捐獻者及MM患者的骨髓穿刺標本。同時，從醫院電子病歷系統獲取MM患者的臨床資料，包括年齡、性別、漿細胞比例、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、肌酐（creatinine，Cr）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、骨質破壞情況，分析SMAD7mRNA相對表達與患者臨床資料的關系。

1.3 細胞和主要試劑

人骨髓瘤細胞KMS11和人胚腎細胞293T均由蘇州大學蘇州醫學院唐仲英醫學研究院血液學研究中心保存。

人淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司，人CD138+磁性微珠購自德國Miltenyi公司，RPMI 1640培養基、DMEM 培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國Gibco 公司，含綠色熒光蛋白（green fluorescent protein， GFP） 標 簽 的pReceiver-Lv215慢病毒空載體質粒（Vector）和pReceiver-Lv215-SMAD7慢病毒重組質粒（Lv-SMAD7）均購自廣州復能基因有限公司，反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒和細胞凋亡試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司，SMAD7 抗體購自美國GeneTex 公司，GAPDH抗體均購自美國ProteinTech公司，CCK8試劑盒、細胞周期檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司，硼替佐米購自美國Selleck公司。

1.4 方法

1.4.1 標本處理 向骨髓穿刺標本中加入等體積0.9%NaCl溶液，以重懸、混勻。將該混合液沿管壁緩慢加入含淋巴細胞分離液的離心管中，室溫下500×g離心30 min。隨后，吸取含淋巴細胞的白膜層細胞置于潔凈離心管中，并向其中加入等體積的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），于300×g離心10 min。棄上清液后用1 mL PBS重懸細胞并計數，向每2×107個細胞中加80 μL 緩沖液及20 μL CD138 磁珠，混勻后于4 ℃避光孵育15 min，最后于MACS磁珠分選器的MS 分選柱中進行分選，以獲得CD138+細胞。

1.4.2 標本骨髓CD138+細胞中SMAD7mRNA 相對表達檢測 采用實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qPCR）檢測SMAD7mRNA 的相對表達。TRIzol 法提取經磁珠分選的CD138+細胞總RNA，經反轉錄試劑盒合成cDNA 后，利用SYBR?qPCR Master Mix 反應體系和StepOne real-time PCR 儀進行qPCR 檢測。具體反應條件參照說明書進行。采用2-ΔΔCT法 分 析SMAD7mRNA 的 相 對 表 達 量，以GAPDH為相對內參。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.4.3 細胞培養 于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中，采用含10% FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養基培養KMS11 細胞，采用含10% FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養基培養293T 細胞。每隔2～3 d 傳代1 次，取對數生長期的細胞行后續實驗。

1.4.4 慢病毒包裝 將293T 細胞以4×106個/皿接種于細胞培養皿中，使用慢病毒包裝試劑盒將質粒Vector、Lv-SMAD7分別與包裝質粒和293T 細胞共轉染14～16 h，而后更換新鮮培養基繼續培養24 h，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液。

1.4.5 慢病毒轉染及穩定過表達SMAD7的細胞株建立 將KMS11細胞以2×105個/孔接種于6孔板，向其中分別加入上述慢病毒上清液進行感染，并添加終濃度為5 μg/mL 聚凝胺提高感染效率。感染24 h后，更換新鮮培養基繼續培養48 h，于熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染效率。同時，待細胞數量達2×106個時，采用流式細胞分選儀分選GFP+細胞，以獲得穩定轉染的KMS11 細胞。而后，采用蛋白質印跡法（Western blotting）驗證轉染KMS11 細胞中SMAD7 的表達效果，以建立穩定過表達SMAD7的KMS11細胞株。

1.4.6 細胞增殖能力檢測 將轉染Vector 或Lv-SMAD7的KMS11 細胞分別按照3×103個/孔接種至96孔板，于37 ℃、5% CO2條件下培養0、1、2、4 d。而后，向每孔加入10 μL CCK8試劑繼續培養4 h，于酶標儀檢測細胞的D（450 nm）并進行統計分析。

1.4.7 細胞周期分布檢測 分別收集轉染Vector 和Lv-SMAD7的KMS11 細胞，用預冷的PBS 進行洗滌，棄盡上清液。用1 mL 預冷的PBS 重懸細胞，并向其中輕輕地邊渦旋邊逐滴滴加3 mL 預冷的無水乙醇溶液直至其終濃度為75%，遂于-20 ℃下對細胞固定過夜。次日，用PBS 洗滌細胞后，向其中加入400 μL PI 染色液，于37 ℃染色30 min，采用流式細胞儀檢測細胞的周期分布。

1.4.8 硼替佐米藥物處理后的細胞活力檢測 將轉染Vector或Lv-SMAD7的KMS11 細胞分別按照8×103個/孔接種于96孔板，向其中添加硼替佐米藥物至終濃度分別為0、20、40、60、80 nmol/L，于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養24 h。而后，向每孔添加15 μL CCK8 試劑繼續培養4 h，于酶標儀檢測D（450 nm）并進行統計分析。

1.4.9 硼替佐米藥物處理后的細胞凋亡檢測 將轉染Vector或Lv-SMAD7的KMS11細胞分別按3×105個/孔接種到6 孔板，并添加終濃度為40 nmol/L 的硼替佐米藥物，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24 h，收集細胞并使用細胞凋亡試劑盒進行染色，于流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。

1.5 統計學方法

使用GraphPad Prism 8.3.0軟件進行數據處理和繪圖。對于符合正態分布的定量資料以±s表示，使用t檢驗進行2 組間比較。對于不符合正態分布的定量資料以M（Q1，Q3）表示，使用Mann-WhitneyU檢驗進行2組間比較。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 GEO數據庫中與MM相關的SMAD7表達分析

對GEO 數據庫中檢索獲取的3 個數據集中的SMAD7表達數據進行分析，結果顯示：GSE5900數據集中，MM患者的2個前期階段MGUS、SMM相較于健康捐獻者，其SMAD7表達均較高（均P=0.000，圖1A）；GSE6477數據集中，新診斷MM患者的SMAD7表達較健康捐獻者有所上調（P=0.001，圖1B）；GSE13591 數據集中，MM、PCL 患者較健康捐獻者，其SMAD7表達均有上調（均P＜0.05，圖1C）。

圖1 GSE5900（A）、GSE6477（B）、GSE13591（C）數據集中與MM相關的SMAD7的表達分析Fig 1 Expression analysis of SMAD7 associated with MM in the GSE5900(A),GSE6477(B)and GSE13591(C)datasets

2.2 SMAD7 mRNA 在健康捐獻者及MM 患者中的相對表達

為進一步分析SMAD7在MM 患者中的表達情況，本研究采用qPCR 分析8 例健康捐獻者及20 例MM 患者骨髓CD138+細胞中SMAD7mRNA 相對表達水平。結果（圖2）顯示，MM 患者SMAD7mRNA 相對表達水平較健康捐獻者有所升高（P=0.002）。

圖2 SMAD7 mRNA 在健康捐獻者及MM 患者的骨髓CD138+細胞中的相對表達Fig 2 Relative expression of SMAD7 mRNA in bone marrow CD138+cells from healthy donors and MM patients

2.3 SMAD7 mRNA 相對表達水平與MM 患者臨床資料的關系

對20 例MM 患者的臨床資料與SMAD7mRNA 相對表達進行統計分析，結果（表1）發現，在患者的性別、年齡、漿細胞比例、Hb 水平、Cr 水平、LDH水平、骨質破壞情況等指標中，SMAD7mRNA 相對表達水平間差異均無統計學意義。

表1 SMAD7 mRNA相對表達水平與MM患者臨床資料的關系Tab 1 Relationship between the relative expression of SMAD7 mRNA and clinical information of patients with MM

2.4 SMAD7對KMS11細胞增殖的影響

為評估SMAD7 在MM 發生與發展中的生物學功能， 本研究分別向KMS11 細胞轉染Vector、Lv-SMAD7，并采用Western blotting 進行檢測；結果（圖3A）發現，與轉染Vector 后的細胞相比，在轉染Lv-SMAD7后的KMS11 細胞中SMAD7 的表達顯著升高，即成功構建了穩定過表達SMAD7 的KMS11 細胞株。

接著， 采用CCK8 法檢測分別經Vector、Lv-SMAD7轉染的KMS11 細胞的增殖能力，結果（圖3B）顯示，與Vector 組細胞相比， Lv-SMAD7組細胞在接種后1、2、4 d 的活力均較高（均P＜0.05）。而后，利用流式細胞術檢測Vector 組和Lv-SMAD7組細胞的周期分布，探究SMAD7對細胞周期的影響；結果（圖3C）顯示，Vector組和Lv-SMAD7組細胞的G0/G1期比例分別為（34.9±1.0）%、（32.3±1.9）%，而S期比例［（59.7±0.5）%vs（57.7±0.7）%］及G2/M 期比例［（5.4±0.8）%vs（10.0±1.3）%］組間差異均具有統計學意義（均P＜0.05）。

圖3 SMAD7對KMS11細胞增殖的影響Fig 3 Effects of SMAD7 on proliferation of KMS11 cells

2.5 SMAD7 對經硼替佐米處理的KMS11 細胞耐藥的影響

采用不同濃度的硼替佐米分別處理經Vector 或Lv-SMAD7轉染的KMS11細胞，而后利用CCK8法檢測細胞的D（450 nm）并計算存活率。結果（圖4A）顯示，在20、40、60、80 nmol/L硼替佐米的作用下，Lv-SMAD7組細胞的存活率均高于Vector 組（均P=0.000）。繼而提示，過表達SMAD7 可降低KMS11 細胞對硼替佐米的藥物敏感性。隨后，根據上述預實驗結果，選取40 nmol/L 的硼替佐米（細胞凋亡率在20%～30%），處 理 經Vector 或Lv-SMAD7轉 染 的KMS11 細胞，利用流式細胞術檢測細胞的凋亡情況。結果（圖4B）顯示，Lv-SMAD7組細胞的凋亡水平低于Vector組。

圖4 SMAD7對經硼替佐米處理的KMS11細胞耐藥的影響Fig 4 Effects of SMAD7 on resistance of KMS11 cells treated with bortezomib

3 討論

目前，MM 的發病率呈逐年上升的趨勢，雖然新型藥物及治療策略的應用已顯著提高了患者的治療反應率、無進展生存率和總生存率，但絕大多數MM患者仍面臨耐藥和復發的問題［6］。因此，尋找新的分子靶點以及為治療MM 提供新的理論基礎具有重要意義。

本研究借助生物信息數據庫分析后發現，SMAD7在MM 中表達上調。隨后，我們收集了8 例健康捐獻者及20 例MM 患者的骨髓標本，qPCR 檢測骨髓CD138+細胞中SMAD7mRNA 的相對表達，并分析其與患者臨床資料的關系。結果發現，與健康捐獻者相比，MM 患者SMAD7mRNA 相對表達較高且差異具有統計學意義；而SMAD7mRNA 相對表達與患者的臨床資料間無顯著相關性，究其原因，可能與樣本量較小有關。

多項研究發現，SMAD7 具有調控細胞增殖、遷移、耐藥等功能。SEHRAWAT 等［10］報道，條件性敲除小鼠胰腺β細胞的SMAD7后，β細胞的增殖受到抑制，提示SMAD7可促進細胞增殖。KLEEFF 等［11］研究表明，約有50%的胰腺癌患者的SMAD7mRNA水平較高，可消除胰腺癌細胞中TGF-β1 的生長抑制效應，從而增強腫瘤的生長、轉移。此外，SMAD7的泛素降解可激活膠質母細胞瘤中的TGF-β 途徑，并參與膠質瘤的上皮間質轉化和化學治療（化療）耐藥［12］。

本研究通過構建SMAD7 過表達的KMS11 細胞，于體外研究SMAD7 的生物學功能。結果顯示，SMAD7能夠促進KMS11細胞的活力、降低由硼替佐米介導的藥物敏感性以及細胞凋亡水平；繼而提示，SMAD7可促進MM細胞的增殖、耐藥。

研究顯示，SMAD7 可抑制TGF-β 信號通路的激活，并在甲狀腺癌［13］、肺癌［14］、結直腸癌［15］等多種癌癥的發生、進展中發揮功能，但其在MM中的作用機制尚不明確。BAUGHN 等［16］在原代MM 細胞及一系列細胞株中均發現，TGF-β 信號通路受阻。YU 等［17］報道，小鼠胚胎干細胞中的SMAD7 可通過依賴白細胞抑制因子（leukocyte inhibitory factor，LIF）的共受體糖蛋白130 激活信號轉導及轉錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3） 通路，以維持胚胎干細胞的多能性。而STAT3 的激活與腫瘤的耐藥性有關，研究［18］發現STAT3 通路激活抑制劑可增強骨髓瘤細胞U266 對化療藥物的敏感性。同時，ZHU 等［19］構建來那度胺耐藥細胞株XG1LenRes 后發現，其STAT3 通路被組成性激活，使用小分子抑制劑BP-1-102 抑制活化的STAT3 蛋白進而可抑制該通路，使得XG1LenRes 可重新對來那度胺敏感。通過上述研究我們推測，在本研究中SMAD7 或可通過STAT3-SMAD7 途徑來發揮MM 細胞的耐藥作用。隨后，我們檢測了經Vector或Lv-SMAD7轉染的KMS11細胞中STAT3蛋白的磷酸化水平，結果顯示過表達SMAD7并沒有增加KMS11細胞中STAT3 的磷酸化（陰性結果未在文中展示），即STAT3 蛋白均處于低磷酸化水平，該結果與ISHIKAWA 等［20］研 究 結 果 相 一 致；繼 而 提 示，SMAD7 對KMS11 細胞增殖、耐藥的影響可能與STAT3通路無關，因此其作用機制仍有待進一步探討。

綜上所述，本研究發現在MM 細胞中SMAD7呈現高表達，且過表達SMAD7 可促進MM 細胞的增殖、耐藥；繼而提示，SMAD7 可能是治療MM 的有效靶點，且針對該相關作用機制仍需進行更深入的探索。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有實驗均已通過蘇州大學附屬第一醫院科學倫理委員會的審核批準（文件號［2022］244）。所有實驗過程均遵照《涉及人的生物醫學研究倫理審查辦法》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by the Scientific Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Soochow University（Approval Letter No.［2022］244，dated 14/06/2022），and all experimental protocols were carried out by following the guidelines ofMeasures for Ethical Review of Biomedical Research Involving Humans.Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻/Authors'Contributions

丁賀、何楊、楊劍峰參與了實驗設計；丁賀、曹楊琳、魏星、楊劍峰參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by DING He，HE Yang and YANG Jianfeng.The manuscript was drafted and revised by DING He，CAO Yanglin，WEI Xing and YANG Jianfeng.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-07

·Accepted：2022-06-24

·Published online：2022-07-28