脂聯素在免疫性血小板減少癥患者外周血中的水平及其對巨核細胞系分化的作用

李昕雨，左 斌，王 文，鈕曉音，翁 震，何 楊

1.蘇州大學附屬第一醫院，江蘇省血液研究所，蘇州 215006；2.蘇州大學唐仲英血液學研究中心，蘇州 215123；3.上海交通大學醫學院，上海市免疫學研究所，上海 200025

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一種以不明原因的血小板減少（外周血小板計數＜100×109/L）為特征的自身免疫性疾病。ITP 患者的臨床癥狀主要表現為出血趨勢的增加，如皮膚、黏膜的自發性出血等，嚴重者可發生危及生命的內臟及顱內出血［1］。因此，有必要探索ITP的病理生理機制以改進ITP的臨床治療方法。

血小板生成減少是ITP主要的致病機制［2］。血小板生成是發生在骨髓微環境中的一系列連續、復雜的過程，主要包括巨核細胞的分化、成熟及血小板釋放3 個階段，該過程中任一階段的異常均有可能導致血小板生成的異常［3］。骨髓脂肪細胞是骨髓微環境中最豐富的細胞。研究［4］發現，骨髓脂肪細胞能夠通過分泌脂聯素、瘦素、白介素-6等脂肪細胞因子調節造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）的增殖和分化。

脂聯素基因是脂肪組織中表達最豐富的基因，它主要參與糖、脂和骨代謝調控，近來發現其還具有抗糖尿病、動脈粥樣硬化和炎癥等多種作用。脂聯素主要通過脂聯素受體（ADIPOR1、ADIPOR2）發揮作用［5］。已有研究［6］表明小鼠HSC 表達ADIPOR1、ADIPOR2，2 種受體能夠通過激活p38 絲裂原激活的蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）促進HSC 的增殖并使細胞保持在不成熟的狀態。但目前尚不清楚脂聯素是否參與了血小板生成的調控。

因此，本研究擬通過檢測ITP 患者血漿脂聯素水平，從臨床角度初步探討脂聯素與ITP 的相關性；并通過體外細胞實驗研究脂聯素及其受體在巨核細胞分化、成熟中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RPMI 1640 培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青霉素-鏈霉素雙抗混合液均購自美國Gibco 公司， TRIzol 購自美國Sigma 公司，HiScript ⅢAll-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR 反轉錄試劑盒、SYBR qPCR Master Mix 試劑盒均購自南京Vazyme 公司，人脂聯素酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒購自美國Proteintech 公司，ADIPOR1 多克隆兔抗體購自英國Abcam 公司，ADIPOR2 多克隆兔抗體、脂聯素受體激動劑AdipoRon 均購自上海愛必信生物科技有限公司，PE 小鼠抗人CD41a 抗體、FITC 小鼠抗人CD41a 抗體均購自美國BD Biosciences 公司，豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）、Hoechst 33342 均購自上海碧云天生物技術有限公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、HRP 羊抗兔二抗均購自美國Proteintech公司。

StepOnePlus ?實時熒光定量PCR 儀購自美國Thermo Fisher 公司，多功能酶標儀購自美國BioTek公司，UVP ChemStudio SA2 多功能凝膠成像儀購自德國Analytikjena 公司，Gallios 流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 臨床資料

2021 年1 月 至2022 年2 月，共 有46 例ITP 患 者及30 名健康對照者被納入研究。ITP 患者來源于蘇州大學附屬第一醫院血液科，健康對照（HC）組來源于蘇州大學附屬第一醫院保健體檢中心。ITP 患者納入標準：臨床確診ITP，其診斷均基于美國血液學會2019 版ITP 指南［7］及《成人原發免疫性血小板減少癥診斷與治療中國指南（2020 年版）》［8］；收集外周血標本前1 個月未接受任何ITP 相關治療。ITP 患者排除標準：存在其他導致血小板減少的原因。HC 組納入標準：均為健康志愿者，其年齡、性別及BMI 與ITP 患者相匹配，外周血小板計數正常。此外，根據ITP 患者臨床病程的不同，將ITP 患者進一步分為新診斷ITP（診斷＜3個月）、持續性ITP（3～12個月）和慢性ITP（＞12個月）3個臨床亞組。

1.3 標本制備

取ITP 患者以及HC 組外周血置于EDTA-K2抗凝管中，1 300×g離心10 min，即獲得EDTA-K2抗凝血漿，并于-80 ℃凍存。

1.4 血漿脂聯素水平的測定

ITP 患者及HC 組血漿脂聯素水平使用人脂聯素ELISA試劑盒檢測，操作按說明書進行。

1.5 細胞培養

人髓系白血病細胞株K562、人巨核細胞白血病細胞株MEG-01 及Dami、人乳腺癌細胞株MCF-7 均由蘇州大學唐仲英血液學研究中心保存。所有細胞相關操作均于超凈臺中進行。MCF-7 細胞培養基為含有10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗混合液的高糖DMEM 培養基；K562、MEG-01 及Dami 細胞培養基為含有10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗混合液的RPMI 1640 培養基。所有細胞于5%CO2、37 ℃飽和濕度的培養箱中培養。

1.6 Western blotting 檢測脂聯素受體在蛋白水平上的表達

取一定數量（一般不低于1×106個細胞）且正處于對數生長期的細胞，經洗滌后，使用細胞裂解液裂解細胞并提取總蛋白。然后行SDS-PAGE，并轉至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。隨后按照抗體說明書的推薦濃度進行ADIPOR1或ADIPOR2相應一抗的孵育，4 ℃孵育過夜。使用PBST 洗膜后，加入相應HRP 標記的二抗，室溫孵育1 h 后進行洗膜、顯影。

1.7 實時熒光定量PCR 檢測脂聯素受體在mRNA水平上的表達

實時熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）需要取一定數量（一般不低于1×106個細胞）且正處于對數生長期的細胞，經洗滌后，使用TRIzol 法提取細胞總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，然后以合成的cDNA為模板，GAPDH為內參，按照試劑盒說明書進行擴增，反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環。熔解曲線階段為95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，95 ℃變性15 s。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物（5'→3'）Tab 1 Primer sequences for RT-qPCR（5'→3'）

1.8 細胞系分化、成熟模型的建立

1.8.1 K562 細胞分化模型 人髓系細胞株K562 在PMA 的刺激下，能夠向巨核細胞系分化［9-11］。根據預實驗結果，使用10 ng/mL 的PMA 刺激K562 細胞，于72 h后使用流式細胞術評估其分化情況。

1.8.2 MEG-01、Dami 細胞成熟模型 人巨核細胞系細胞株MEG-01、Dami 在PMA 的刺激下，能夠進一步成熟［12-15］。根據預實驗結果，使用10 ng/mL 的PMA 刺激MEG-01、Dami 細胞，于72 h 后使用流式細胞術評估其成熟情況。

1.9 流式細胞術檢測巨核細胞系的分化

收集需要檢測的各組細胞分別置于15 mL離心管中，300×g離心5 min，棄上清液。使用100 μL PBS重懸細胞，每管加入PE-CD41a 抗體5 μL，室溫避光孵育30 min。孵育結束后，每管加入1 mL PBS 進行洗滌，于300×g離心5 min，棄上清液。隨后，每孔加入300～400 μL PBS 重懸，上機檢測，統計CD41+細胞百分比以評估細胞分化情況。

1.10 流式細胞術檢測巨核細胞系的成熟

收集需要檢測的各組細胞分別置于15 mL離心管中，300×g離心5 min，棄上清液。使用100 μL 含有DNA 染料Hoechst 33342（10 μg/mL）的PBS 重懸細胞，每管加入FITC-CD41a 流式抗體5 μL，室溫避光孵育30 min。孵育結束后，每管加入1 mL PBS 進行洗滌，于300×g離心5 min，棄上清液。隨后，每孔加入300～400 μL PBS 重懸，上機檢測，統計CD41+細胞百分比、CD41 表達量即平均熒光強度（mean fluoresence intensity，MFI）、多倍體細胞（≥4N）百分比3個指標以評估細胞成熟情況。

1.11 統計學處理

使用GraphPad Prism 8 軟件進行統計分析。使用D′Agostino-Pearson 正態性檢驗對ITP 患者、HC 組及各亞組的數據進行正態性分析，由于各組數據均不滿足 正 態 分 布， 故 數 據 采 用M（Q1，Q3） 或M（Min～Max）表示，并使用Mann-Whitney 檢驗比較ITP 患者和HC 組之間、各亞組之間血漿脂聯素水平的差異。Spearman 相關性分析用于確定血漿脂聯素水平與ITP 患者體質量指數（body mass index，BMI）之間的相關性。細胞實驗部分使用Student′st檢驗分析數據，數據均來自3 次及以上獨立實驗結果。雙側檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ITP患者和HC組的臨床特征

參與本項研究的ITP 患者以及HC 組的臨床特征如表2所示。共有46例ITP患者和30名年齡、性別與ITP 患者相匹配的健康對照者被納入統計。ITP 患者與HC 組的血小板計數中位數分別為32.0×109/L 和220.5×109/L（P=0.000），其他一般特征差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

表2 ITP患者及HC組的臨床資料Tab 2 Clinical information of ITP patients and healthy controls

2.2 ITP患者和HC組血漿脂聯素水平

46 例ITP 患者及30 名健康對照者的血漿脂聯素水平如圖1所示。與HC組相比，ITP患者血漿中脂聯素水平顯著升高（P=0.000）。

圖1 ITP患者和HC組血漿脂聯素水平Fig 1 Plasma adiponectin levels in the ITP patients and the healthy controls

既往研究［16］發現，血漿脂聯素水平與被檢者BMI呈負相關。為了確定ITP患者血漿脂聯素水平的升高是否與患者BMI相關，我們對ITP患者的血漿脂聯素水平與其BMI進行相關性分析，并根據中國BMI參考標準將ITP患者分為BMI＜24 kg/m2（n=23）和BMI≥24 kg/m2（n=23）2個亞組比較血漿脂聯素水平的差異。結果如圖2所示：ITP患者的血漿脂聯素水平與BMI之間無相關性（P=0.621），且2個BMI亞組的ITP患者的 血漿脂聯素水平差異無統計學意義（P=0.295）。

圖2 ITP患者血漿脂聯素水平與BMI之間的關系Fig 2 Relationship between plasma adiponectin level and BMI in the patients with ITP

2.3 不同病程的ITP患者血漿脂聯素水平

結果如圖3 示：與HC 組相比，3 種不同病程的ITP 患者，即新診斷ITP 患者（P=0.001）、持續性ITP 患者（P=0.003） 及慢性ITP 患者（P=0.001），其血漿脂聯素水平均呈現不同程度的升高。但不同病程的ITP 患者之間的血漿脂聯素水平并無明顯差異。

圖3 不同病程的ITP患者血漿脂聯素水平Fig 3 Plasma adiponectin levels in the ITP patients with different courses of disease

2.4 ADIPOR1、ADIPOR2 在K562、MEG-01、Dami細胞株中的表達

脂聯素主要通過其受體ADIPOR1和ADIPOR2發揮作用。因此，為明確脂聯素在巨核細胞分化、成熟中的作用，必須首先確定脂聯素受體在相關細胞中的表達。

我們利用RT-qPCR、Western blotting 技術分別在mRNA水平和蛋白水平上研究脂聯素受體在髓系細胞株K562，巨核細胞系細胞株MEG-01、Dami 中的表達，并選用乳腺癌細胞株MCF-7 作為ADIPOR1、ADIPOR2 表達的陽性對照［17］。結果如圖4 所示：K562、MEG-01 及Dami 細胞在mRNA 水平及蛋白水平均表達ADIPOR1、ADIPOR2。

圖4 脂聯素受體在K562、MEG-01、Dami細胞株中的表達(n=4)Fig 4 Expression of adiponectin receptors in the cell lines K562,MEG-01 and Dami(n=4)

2.5 脂聯素受體激動劑對髓系細胞株K562分化的影響

將不同濃度的AdipoRon（1、10 及20 μmol/L）與PMA 共同培養K562 細胞，對照組為PMA+DMSO組。培養72 h后使用流式細胞術檢測CD41+細胞百分比。結果如圖5所示：較PMA+DMSO 組，10μmol/L和20μmol/L AdipoRon 處理組的CD41+細胞百分比顯著降低（均P=0.000）。

圖5 流式細胞術檢測脂聯素受體激動劑對K562細胞株分化的影響(n=4)Fig 5 Effect of AdipoRon on the differentiation of the cell line K562 detected by flow cytometry(n=4)

2.6 脂聯素受體激動劑對巨核細胞系細胞株MEG-01和Dami成熟的影響

將不同濃度的AdipoRon（1、10 及20 μmol/L）與PMA 共同培養MEG-01、Dami 細胞，對照組為PMA+DMSO 組。培養72 h 后使用流式細胞術檢測細胞成熟相關指標，即CD41+細胞百分比、CD41 表達量（CD41-MFI）、 多 倍 體（≥4N） 細 胞 比 例。MEG-01 細胞株結果如圖6 所示：與PMA 對照組相比，20 μmol/L AdipoRon 處理組的CD41 表達量（P=0.047）與多倍體細胞比例（P=0.003）均出現顯著增加。在Dami細胞株上，各濃度AdipoRon處理組的細胞CD41 表達量以及多倍體細胞比例較對照組均未顯著增加（圖7）。

圖6 流式細胞術檢測脂聯素受體激動劑對MEG-01細胞株成熟的影響(n=3)Fig 6 Effect of AdipoRon on maturation of the cell line MEG-01 detected by flow cytometry(n=3)

圖7 流式細胞術檢測脂聯素受體激動劑對Dami細胞株成熟的影響(n=3)Fig 7 Effect of AdipoRon on maturation of the cell line Dami detected by flow cytometry(n=3)

3 討論

ITP 是發病機制尚未完全明確的一種自身免疫性疾病，患者體內產生的包括抗血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（platelet glycoprotein Ⅱb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa）和抗血小板膜糖蛋白Ⅰb/Ⅸ（platelet glycoprotein Ⅰb/Ⅸ，GPⅠb/Ⅸ）在內的病理性血小板自身抗體是發生血小板破壞的重要原因［2］。但值得注意的是，在ITP的實驗診斷研究［18-20］中，血小板自身抗體（GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ）檢出率僅為50%～70%。此外，研究［21-22］發現，TPO 并不是血小板生成這一過程中唯一的調控因子。因此，推測存在其他因素共同參與了ITP的發生。

近年來，有研究［4］報道：脂聯素、瘦素等多種脂肪細胞因子與骨髓造血穩態的維持、某些血液疾病的發生等息息相關。在本研究中，我們通過檢測ITP患者血漿脂聯素水平，從臨床角度初步探討了脂聯素與ITP 的相關性，為后續的體外實驗提供了臨床基礎。結果發現：不同病程的ITP 患者血漿脂聯素水平均顯著高于HC 組。另外，既往研究對被檢者的脂聯素水平與其BMI 的相關性進行了報道。NIELSEN等［16］發現：被檢者的血漿脂聯素水平與其BMI呈負相關，這種相關性未針對特定人群。而KUO 等［23］發現：對健康成人進行的研究并不支持BMI 影響脂聯素血漿水平的報道；研究人員考慮已報道的與肥胖相關的包括脂聯素在內的血漿脂肪因子水平變化可能是肥胖相關代謝紊亂的結果。因此，為排除ITP 患者升高的血漿脂聯素水平可能受其BMI 的影響，我們對兩者進行了相關性分析，并對BMI＜24 kg/m2和BMI≥24 kg/m22 個亞組的ITP 患者血漿脂聯素水平進行比較。結果均表明ITP 患者血漿脂聯素水平的升高與BMI變化無關。另一方面，本研究中選取的HC 組的BMI 與ITP 組相比無明顯差異。據此，我們認為ITP患者血漿脂聯素水平較HC組的升高是由ITP疾病本身引起的。

在細胞實驗中，我們確定了人髓系細胞株K562、巨核細胞系細胞株MEG-01 及Dami 均表達脂聯素受體ADIPOR1 和ADIPOR2；并發現脂聯素受體激動劑能夠抑制巨核細胞的分化。CHANG 等［24］研究發現：將ITP 患者的血漿加入巨核細胞體外分化體系后，體外培養得到的巨核細胞數量減少，且是由病理性的血小板自身抗GPⅠb、抗GPⅡb/Ⅲa抗體所致。在K562細胞株的分化模型中，高濃度脂聯素激動劑（10、20 μmol/L AdipoRon）處理組的CD41+細胞比例顯著下降，故推測脂聯素能夠抑制髓系細胞向巨核細胞系分化。雖然ITP 患者的血漿脂聯素水平增高可能引起巨核細胞數量的減少，從而解釋ITP 患者血小板生成的減少，但在臨床上，僅有少部分ITP 患者會出現巨核細胞數量的減少，大多數患者的巨核細胞數量正常或呈增加趨勢。

MCMILLAN等［25］發現ITP患者血漿不僅能使體外培養的巨核細胞數量減少，而且能夠抑制巨核細胞成熟，即導致4N、8N 和16N 細胞減少。此外，YANG 等［26］觀察到大多數ITP 患者的血漿能夠增加巨核細胞的生成但使巨核細胞出現成熟障礙，即多倍體細胞顯著減少。在巨核細胞MEG-01 成熟模型中，我們發現20 μmol/L AdipoRon 對巨核細胞株MEG-01多倍體化具有促進作用，但在Dami 細胞株中未發現上述現象。故尚不能確定脂聯素對巨核細胞成熟的影響。

綜上，本研究發現ITP 患者血漿脂聯素水平升高，髓系、巨核細胞系細胞株上表達脂聯素受體，且脂聯素受體激動劑對巨核細胞分化具有抑制作用。值得注意的是，巨核細胞的多倍體化是巨核細胞成熟的重要表現；在臨床上，多數ITP 患者的巨核細胞有成熟障礙的表現。但本研究反而在一個巨核細胞株上觀察到脂聯素受體激動劑對多倍體化的促進作用。后續，我們將建立人造血干細胞體外分化巨核細胞模型，系統研究脂聯素對巨核細胞分化、成熟及血小板生成過程的影響。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有實驗均已通過蘇州大學附屬第一醫院醫學倫理委員會的審核批準［文件號2020倫審（申報）批第452號］。所有實驗過程均遵照世界醫學會的《赫爾辛基宣言》的條例進行。受試對象或其親屬均簽署知情同意書。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by the Medical Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Soochow University （Approval Letter No. 2020-452），and all experimental protocols were carried out by following the guidelines ofHelsinki Declarationof the World Medical Association.Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻/Authors'Contributions

李昕雨、左斌、何楊、鈕曉音參與了實驗設計；李昕雨、左斌、王文參與了實驗操作；李昕雨、左斌、何楊、翁震、鈕曉音參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by LI Xinyu，ZUO Bin，HE Yang and NIU Xiaoyin.The study was operated by LI Xinyu，ZUO Bin and WANG Wen.The manuscript was drafted and revised by LI Xinyu，ZUO Bin，HE Yang，WENG Zhen and NIU Xiaoyin.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-02-24

·Accepted：2022-07-12

·Published online：2022-07-28