基于生物信息學探討敗醬散調控氧化應激緩解克羅恩病的機制

陸文鵬, 陳 民, 陳 潔, 鄭新梅, 董小耘

(1. 揚州大學醫學院, 江蘇 揚州, 225000 2. 江蘇省蘇北人民醫院 消化科, 江蘇 揚州, 225000)

克羅恩病(CD)屬于炎癥性腸炎(IBD), 是一種影響胃腸道的慢性炎性肉芽腫性疾病[1-2]。目前, CD尚不能根治，西醫主要以抗炎藥、免疫抑制藥物[3]和抗腫瘤壞死因子為主的生物制劑治療，這些藥物服用期間限制較多，且療效有限；新型藥物如抑制淋巴細胞遷移的調節劑、靶向腸道組織降解和重塑的抑制劑等尚在研發中[4]。中醫藥辨證論治CD，具有獨特療效。

CD的臨床特點與中醫的“腸癰”“肛庸”“痔漏”“流注”相似，臨床可從“腸癰”的角度來論治CD[5]。敗醬散是治療腸癰代表方[6], 出自《金匱要略》，由薏苡仁、附子、敗醬草三味藥組成，該方能排膿消癰，振奮陽氣，臨床應用廣泛，對IBD療效顯著[7]。目前對該方治療潰瘍性結腸炎(UC)研究較多, CD與UC早期難以鑒別，根據中醫辨證論治思想，該方亦適用于CD, 但對其治療CD作用機制的研究較少。本研究基于生物信息學探討敗醬散調控氧化應激(OS)緩解CD的活性成分、潛在靶點、通路及機制，為進一步實驗提供方向。

1 數據庫及軟件

TCMSP數據庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php); Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/); GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/); String11.5在線平臺(https://stringdb.org); Genecards數據庫(https://www.genecards.org/); Enrichr數據庫(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/); Mirtarbase數據庫(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.html); Starbase數據庫(https://starbase.sysu.edu.cn); Targetscan數據庫(http://www.targetscan.org/vert_71/); Rstudio軟件或R4.1.2軟件; Cytoscape3.8.2軟件。

2 資料與方法

2.1 CD相關靶點篩選

利用GEO數據庫，以“crohn′s disease”為檢索詞，通過篩選，下載GSE36807、GSE59071、GSE102133數據集以及對應GPL平臺文件，將上述數據集中CD組(CD,n=86)以及對照組(正常,n=30)合并、矯正，使用R軟件利用“Limma”包以lgFC>1、矯正后P<0.05為條件篩選出差異表達基因，將這些基因作為疾病作用靶點。

2.2 藥物活性成分及靶點篩選

以口服利用度(OB)≥30%, 類藥性(DL)≥0.18為有效活性成分篩選條件，在TCMSP數據庫篩選，獲取薏苡仁、附子、敗醬草3味中藥有效成分。結合TCMSP中Relate Targets的文件得到有效成分對應的靶點，再通過Uniprot數據庫中注釋文件，將靶點名轉化為基因名。

2.3 OS相關基因獲取

在Genecards數據庫中以“oxidative stress”為關鍵詞搜索相關基因，以“Relevance score≥7”為條件篩選獲得OS相關基因。

2.4 藥物與疾病共同靶點篩選及作用靶點網絡構建

將2.1中的疾病靶點與2.2中藥物靶點以及2.3中獲取的OS相關基因取交集，繪制韋恩圖，得到共同靶點數據，將其導入Cytoscape, 同時將上述“2.2”獲得的活性成分及靶點關系數據導入進行調控網絡構建。

2.5 蛋白互作(PPI)網絡圖構建與核心靶點篩選

將共同靶點導入String數據庫，獲取PPI網絡圖。下載TSV文件，導入Cytoscape軟件，使用Cytohubba插件篩選出核心靶點。Cytohubba可準確篩選出網絡中的重要節點，其中最大集團中心度(MCC)算法已被證實是預測重要靶點較為精確的方法[8]。

2.6 基因富集分析

通過R軟件中相關的Bioconductor安裝包，設置P=0.05,Q=0.05, 進行靶點基因的基因本體(GO)富集分析，保存富集結果并選取生物過程、細胞組分、分子功能各自前10位繪圖。采用同樣方法進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析，并繪制與本研究相關的信號通路圖。

2.7 微小RNA(miRNA)、轉錄因子(TF)預測及調控網絡構建

使用Mirtarbase[9]、Starbase[10]和Targetscan[11]數據庫預測共同靶點的靶向miRNA。取3個數據庫交集miRNA作為預測的靶向miRNA。與共同靶點相關TFs在Enrichr數據庫以P≤0.05為條件預測。將三者調控關系導入Cytoscape軟件繪制調控網絡圖。

3 結 果

3.1 CD靶點篩選結果

在GEO數據庫中獲取CD相關數據: GSE36807、GSE59071、GSE102133數據集，選取其中正常組以及CD組，對數據進行歸一化處理、合并、批次矯正。差異分析共得到差異基因175個，其中上調基因135個、下調基因40個，數據信息見表1。

表1 數據集信息表

3.2 藥物成分及靶點篩選結果

使用TCMSP數據庫搜索藥物的成分，篩選后得到有效成分: 薏苡仁9個，附子21個，敗醬草13個，見表2。

表2 藥物有效成分

3.3 活性成分與作用靶點網絡圖

將敗醬散調控靶點與CD差異基因以及OS相關基因取交集，共有14個基因，得到圖1A及交集數據，將交集數據以及藥物成分與靶點關系導入Cytoscape軟件，繪制調控網絡圖1B, 包含30個節點、39條邊，其中潛在基因靶點14個，對應的有效成分16個。對應靶點較多的敗醬草的活性成分槲皮素對應11個靶點，其次是山奈酚對應6個靶點; 對應活性成分較多的靶點是前列腺素內過氧化物合成酶2(PTGS2, 對應16個活性成分)，細胞間黏附分子-1(ICAM1)、一氧化氮合酶2(NOS2)和基質金屬蛋白酶1(MMP1)分別對應3個活性成分，可能為敗醬散調控OS緩解CD的重要靶點。

3.4 PPI網絡與核心靶點

將14個共同靶點基因導入String數據庫，設置置信度≥0.4, 并剔除獨立于網絡以外的靶點可得到圖2A, 獲取PPI相關信息，利用Cytoscape軟件對PPI信息進行可視化，并使用Cytohubba插件篩選排名前5的核心基因，見圖2B、表3。

表3 MCC得分前5位基因列表

3.5 富集分析

使用R軟件對作用靶點基因進行GO富集分析得到圖3。結果顯著富集于調控脂多糖(response to lipopolysaccharide)、調控細菌起源的分子(response to molecule of bacterialorigin)、細胞外間質組織(extracellular matrix organization)、細胞外結構組織(extracellular structure organization)等生物過程; 薄膜筏(membrane raft)、膜微區(membrane microdomain)等細胞組成; 絲氨酸型內肽酶活性(serine type endopeptidase activity)等分子功能。

使用R軟件進行KEGG富集分析，共富集到35條通路關系，排第1的晚期糖基化終產物及其受體(AGE-RAGE)信號通路圖見圖4, 該信號通路內含有絲裂原活化蛋白激酶(MAKP)、磷脂酰肌醇3′-激酶(PI3K-AKT)等信號通路，且涉及OS反應，可能是敗醬散調控OS緩解CD的重要通路。對應靶點數大于5的通路見表4。

表4 KEGG分析對應靶點數大于5的通路

3.6 miRNA-TF-mRNA調控網絡

Mirtarbase數據庫中預測出486個miRNA, Starbase數據庫預測出185個miRNA, Targetscan數據庫預測出4 679個miRNA, 3個數據庫預測共有76個miRNA。Enrichr數據庫中篩選出轉錄因子(TF)共5個，分別是甲狀腺素受體(THRA)、含葡萄球菌核酸酶域1(SND1)、轉錄因子Sp4(SP4)、母親DPP同源物3(果蠅)SMAD(SMAD3)、v-rel網狀內皮細胞過多癥病毒癌基因同源物A, B細胞κ輕肽基因增強子核因子3, p65(鳥類, RELA), 這些miRNA、TF參與調控的通路可能與敗醬散調控OS緩解CD有關。miRNA-TF-mRNA調控網絡見圖5, 有93個節點, 343個邊。紅色圓形代表預測的TF, 藍色三角形是共同靶點基因，綠色正方形是miRNA。

4 討 論

目前, CD的病因、病機尚未明確，可能與遺傳因素、機體免疫功能、神經-體液調節功能、生活習慣及環境因素、腸道微生物等[12]相關。研究[13]發現，潰瘍的發生發展與OS密切相關, CD常伴有潰瘍。OS在CD發病機制中的關鍵作用已得到廣泛認可，但具體機制仍未闡明。

OS的發生與抗氧化能力和自由基即活性氧(ROS)、活性氮(RNS)及其他未配對電子的分子平衡有關，過量自由基會導致氧化負荷與抗氧化能力失衡[14]發生OS; 同時OS可導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產生大量ROS。ROS一方面能參與細胞穩態; 另一方面除了對細胞產生直接損害，還可與DNA、脂質、氨基酸、細胞發生反應導致衰老、疾病和細胞死亡[15]。研究表明, CD中OS的發生與自由基、各種參與OS的酶、環境因素有關。

敗醬散活性成分中的槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗菌抗炎、免疫調節等功能，研究[16]表明其可增強抗氧化酶活性，減少自由基生成，從而抑制OS發生。槲皮素可作用于AKT-PKB-mTOR、Nrf2-ARE[17-18]等多種信號通路，參與OS發生。山奈酚是一種眾所周知的抗氧化劑，能通過激活腺苷酸活化蛋白激酶/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(AMPK/NOX4)等信號通路，抑制細胞增殖、ROS產生、NOX4等表達[19]緩解OS。

蛋白互作網絡篩選出的核心基因有IL-1β、PTGS2、CXCL8、ICAM1、KDR。研究[20]表明, IL-1β能激發OS, 致使多種細胞衰老, CD中IL-1β表達升高，下調其表達能促進結腸炎性損傷的恢復[21]。PTGS2也被稱為環氧化酶-2(COX-2), 是CD活動期關鍵基因[22]。研究[23]發現，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)通過調節p38絲裂原活化蛋白激酶(P38-MAPK)通路產生PTGS2和熱休克蛋白27(Hsp27), 刺激結腸肌成纖維細胞遷移，致使CD發生。CXCL8在CD患者中高表達，且與疾病活動相關[24], 未受刺激的細胞中幾乎難以檢測到CXCL8, 其表達可受包括ROS在內的多種因素的刺激調控[25]。ICAM1屬于黏附分子免疫球蛋白超家族，參與機體免疫功能、炎癥反應等的調控，其表達量在CD發病中顯著升高[26], OS可快速激活MAPK通路，刺激ICAM1轉錄[27]。KDR是血管上皮因子受體，與血管內皮生長因子(VEGF)結合后，可介導內皮細胞增殖，促進血管生成[28], 減輕炎癥反應及OS反應。

富集分析中涉及AGE-RAGE、核因子κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子(TNF)等信號通路。研究[29]發現AGE-RAGE信號通路激活在CD的局部炎癥級聯反應中起重要作用。激活該通路可以提高煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性，促進ROS產生，使OS過度激活，經級聯反應誘導細胞凋亡、變性壞死，加重微血管病變[30]。NF-κB通路對細胞自噬有抑制作用，研究[31]發現抑制NF-κB通路表達，能激活CD模型小鼠結腸自噬表達。同時NF-κB是氧化應激時細胞內的靶點，參與氧化還原調節, CD患者體內產生的大量自由基，除了直接損傷腸黏膜屏障外，還可激活NF-κB通路，導致腸道發生炎性反應[32]。在CD炎癥過程早期, TNF-α即可被檢測到[33]。抗TNF-α治療是治療CD的手段之一，該方案對重度和具有2種及以上不良預后危險因素的CD患者有較好療效[34], 這與抗TNF-α療法可減輕CD患者的氧化應激有關。在CD中有表達差異的miRNA可作為診斷生物標志物。本研究預測的76個miRNA中, miR-145-5p被證實通過抑制性別決定區域Y(SRY)相關的高遷移率族框9(SOX9)表達和恢復靠停蛋白8(CLDN8)表達來緩解三硝基苯磺酸9(NBS)誘導CD小鼠結腸炎癥[35]。OS能通過NF-κB信號通路誘導miR-122的DNA甲基化，促進CD的進展[36]。

本研究結合OS相關差異基因，探討OS緩解CD相關機制。本研究采用生物信息學分析發現敗醬散調控OS可能與IL-1β、PTGS2、CXCL8、ICAM1、KDR等靶點有關，涉及通路主要為AGE-RAGE、NF-κB、TNF信號通路等，同時還預測了相關miRNA以及TF。但本研究以預測為主，其準確性還有待進一步進行體內外實驗探討。