Roux-en-Y胃旁路術前后肥胖癥患者肌肉組織的差異表達基因和藥物靶點分析

林 藝, 鄭建偉, 俞 巍, 馮國勛, 閆文貌, 白日星

(首都醫科大學附屬北京天壇醫院, 1. 普通外科, 2. 腫瘤綜合治療中心, 北京, 100070)

肥胖癥是一種代謝疾病，可導致患者出現嚴重的健康問題，其已逐漸成為全球范圍內公共衛生領域的研究焦點[1-2]。減重代謝外科手術在歐美國家已被廣泛應用于肥胖及相關并發癥的治療中，但其在中國的應用仍處于發展階段[3]。目前，全腹腔鏡胃旁路術(TLGBP)被認為是治療伴2型糖尿病的肥胖患者的標準術式[4-5]。相關研究[6-7]顯示, Roux-en-Y胃旁路術(RYGB)不僅可減輕患者體質量，而且可改善其代謝紊亂。另有研究[8]顯示，人體的主要代謝場所之一是骨骼肌，其代謝受損與肥胖癥誘發的胰島素抵抗等代謝異常關系密切。本研究探討RYGB對肥胖癥患者肌肉組織基因表達的影響，分析差異表達基因及其生物學功能，并進行藥物靶點預測，以期探尋肥胖癥的潛在治療藥物。

1 資料與方法

1.1 RYGB相關基因芯片數據來源

基因芯片數據來源于GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), 檢索策略為: Roux-en-Y[All Fields] AND “Homo sapiens”[porgn]。納入RYGB術前和術后肌肉組織樣本[樣本總量>10例，術前和術后均有體質量指數(BMI)信息]的RNA表達數據集，并排除樣本接受體外培養等處理的數據集。經篩選, GSE161643數據集符合研究標準，其包含RYGB術前和術后患者肌肉組織樣本、表達數據和實驗平臺等信息。通過R軟件和GEO query、limma等數據包篩選差異表達基因，以P<0.05且logFC>1或logFC<-1作為篩選條件。

1.2 基因集富集分析

以“msigdb.v7.4.entrez.gmt”為預設基因集，對納入數據集進行分析，計算標準化富集評分(NES)后降序排列，根據基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析結果取校正P<0.05且q<0.05的基因集。

1.3 免疫細胞浸潤分析

利用CIBERSORT算法進行免疫細胞浸潤分析，通過計算獲得標準化基因表達數據，分析免疫細胞的比例。評估并比較每個樣本的免疫成分評分和基質成分評分，評分越高表示對應組分在微環境中的比例越高。

1.4 靶點-化合物相互作用分析

利用STITCH數據庫(http://stitch.embl.de/)構建靶點-化合物相互作用網絡，尋找靶點和化合物之間的相互作用關系，然后下載相互作用的信息文件，并通過Cytoscape軟件(版本號3.8.1)打開，利用“Network Analyzer”插件分析藥物作用的關鍵靶點，篩選degree大于3且排名前10位的蛋白作為關鍵靶點。

1.5 關聯性圖譜(CMap)分析

CMap(https://clue.io/query)是活性化合物或藥物相關基因表達譜數據庫，能夠利用生物信息學工具分析和挖掘藥物、基因和疾病之間的聯系。通過touchstone(https://clue.io/touchstone)將差異表達基因與化合物的參考表達譜進行比較，得到與肥胖相關的小分子化合物或藥物，然后通過Venn圖篩選出共同作用于肥胖的候選藥物。

1.6 統計學分析

采用limma數據包中的Student′st檢驗方法篩選RYGB術前和術后肌肉組織的差異表達基因，篩選標準為|logFC|>1且P<0.05。免疫差異采用Student′st檢驗比較。所有數據使用R軟件(版本4.0.2)進行統計分析,P<0.05為差異有統計學意義。GO通路和KEGG分析選擇差異具有統計學意義(P<0.05)的信號轉導通路。

2 結 果

2.1 RYGB手術對肥胖癥患者肌肉組織基因表達的影響

篩選GEO數據庫中RYGB術前和RYGB術后配對的肌肉組織樣本，對GSE161643數據集的表達譜數據(共納入病例22例，包括RYGB術前病例、RYGB術后病例各11例)進行生物信息學分析。全部基因和差異基因的分布情況通過繪制火山圖(圖1)進行展示，差異表達基因在樣本中的表達通過繪制熱圖(圖2)進行呈現。分析結果顯示, RYGB術后肌肉組織的基因表達譜與RYGB術前存在顯著差異，共篩選出差異表達基因74個，其中表達上調基因30個、表達下調基因44個。

2.2 RYGB術后肥胖癥患者肌肉組織基因的基因集富集分析

芯片數據集的基因集富集分析結果提示, GSE161643數據集富集于8個GO功能，分別為GO∶0006397、GO∶0008380、GO∶0000377、GO∶0000398、GO∶0000375、GO∶0050684、GO∶0005681、GO∶0043484, 主要圍繞mRNA加工、RNA剪接、mRNA加工的調控、RNA剪接的調控等過程。GO功能富集的前5個生物過程的可視化結果見圖3, 分別為: ① mRNA加工; ② mRNA剪接，通過剪接體; ③ RNA剪接; ④ RNA剪接，通過酯交換反應; ⑤ RNA剪接，通過酯或醇交換反應將腺苷形成核苷化合物。KEGG通路富集分析結果顯示, GSE161643數據集富集于hsa05168(單純皰疹病毒1型感染)，富集評分442 ,q=0.025 9。

2.3 RYGB術前和術后肌肉組織基因的免疫細胞浸潤分析

應用ESTIMATE分別計算RYGB術前和RYGB術后的肌肉組織樣本中基質細胞和免疫細胞的比例，并生成基質成分評分和免疫成分評分。分析結果顯示, RYGB術后肌肉組織的基質成分評分、免疫成分評分與RYGB術前比較，差異均無統計學意義(P>0.05), 見圖4。

2.4 STITCH靶點-化合物網絡

利用STITCH數據庫分析與基因靶點相互作用的化學成分，將上述基于GSE161643數據集篩選出來的差異表達基因導入STITCH數據庫，構建相互作用網絡。該網絡共有25個蛋白靶點，但

沒有找到與網絡關聯的化合物，見圖5。利用Cytscape 軟件對構建的相互作用網絡進行分析，共篩選出關鍵靶點10個，分別為UBC、CDK1、ERBB2、CDK2、CHEK2、CDC25A、ERBB3、SHC1、CHEK1和BTRC。

2.5 CMAP藥物靶點篩選

利用CMap數據庫篩選出關鍵靶點基因，尋找治療肥胖癥的潛在候選小分子化合物。選擇排名前3位的關鍵靶點基因，即UBC、CDK1、ERBB2, 輸入CMap的touchstone(https://clue.io/touchstone), 比對關鍵靶點基因譜與CMap中的參照基因表達譜，得到相關的小分子化合物。應用Venn圖篩選出共同作用于UBC、CDK1、ERBB2的9個小分子化合物，分別為氯吡格雷、BNTX、香豆素、左氧氟沙星、SID-26681509、依折麥布、異丁香酚、渥曼青霉素和PSB-06126，這些化合物可能成為候選治療藥物，見圖6、表1。

表1 共同作用于UBC、CDK1、ERBB2的小分子化合物

3 討 論

肥胖癥是一種慢性病，其所引起的糖尿病、心血管疾病、高血壓病等伴隨疾病已成為全球范圍內嚴重的公共衛生問題[9-10]。相較于節食、運動和藥物治療等保守治療方法，外科減重手術能更有效且持久地降低肥胖患者的體質量，改善糖代謝，減少肥胖相關并發癥[11]。WITTGROVE A C等[12]于1994 年報道了全腹腔鏡下RYGB術式，目前該術式已經成為減重代謝外科中最被認可的術式之一，但其改善代謝的機制尚未闡明。本研究對RYGB手術前后肌肉組織的基因表達數據進行深入挖掘，共篩選出差異表達基因74個，其中上調基因30個、下調基因44個，這些差異表達基因富集于8個GO功能，包括mRNA加工、RNA剪接、mRNA加工的調控、RNA剪接的調控等過程; KEGG通路富集分析顯示, GSE161643數據集富集于hsa05168(單純皰疹病毒1型感染); 構建靶點-化合物相互作用網絡，分析后共篩選出10個關鍵靶點; 進一步篩選針對關鍵基因的小分子化合物，共得到9個小分子化合物，可作為治療肥胖癥的候選藥物。

骨骼肌是人體的主要代謝場所之一，其代謝受損與肥胖癥誘發的胰島素抵抗等代謝異常關系密切，而骨骼肌胰島素抵抗被認為是肥胖和2型糖尿病的一個重要特征[8]。減重手術后骨骼肌中某些基因或蛋白質的表達會發生變化, GASTALDI G等[13]發現, RYGB術后肌肉組織的PGC1A表達上調，進而刺激MFN2表達，且多因素分析顯示MFN2表達與胰島素敏感性改善相關。LEICHMAN J G等[14]研究了RYGB術和胃綁帶術后肌肉代謝和心臟的變化，發現SCD、PDK4表達水平在術后早期下降，第3、9個月時SCD、PDK4轉錄水平顯著降低，而PPARα及其調控的基因(MACD、CPT1、UCP3)在手術后期表達下降，同時血漿游離脂肪酸濃度下降，手術后第9個月時胰島素敏感性恢復，血漿瘦素降低，心臟超聲顯示左心室舒張障礙恢復正常。ALBERS P H等[15]發現，在RYGB術后12個月，骨骼肌中GLUT4蛋白表達增加，胰島素信號分子(如胰島素受體Akt和TBC1D4)磷酸化增強，糖原合酶活性改善。TAMBOLI R A等[16]發現，減重手術后 6、12 個月骨骼肌炎癥相關基因(ANKRD1、CDR1、CH25H、CXCL2、CX3CR1、IL8、LBP、NFIL3、SELE、SOCS3、TNFAIP3和ZFP36)表達降低，且IL6、CCL2的表達在術后所有時點均下降。相關研究[17]發現，肥胖和RYGB對骨骼肌蛋白質組有動態影響, 260種蛋白質在肥胖者中表達顯著減少，135種蛋白質表達顯著增加, RYGB術后, 49種蛋白質恢復至正常水平。KEGG通路分析顯示，富集于核糖體途徑以及胰島素信號蛋白(包括MAP激酶和GLUT定位的蛋白質)的豐度增加和正常化。本研究結果顯示，表達上調基因30個、表達下調基因44個，與其他文獻報道的基因并不完全一致，提示存在個體和人種差異。此外，富集分析結果提示，生物學功能主要圍繞mRNA加工、RNA剪接、mRNA加工的調控、RNA剪接的調控等過程，而KEGG富集于單純皰疹病毒1型感染。

本研究結果提示,CDK1、UBC和ERBB2是肥胖代謝過程中的關鍵靶點基因。相關研究[18]稱CDK1-SIRT3-CPT2級聯能夠調節人體內有害脂肪棕櫚酸的代謝，該過程通過增強線粒體代謝穩態實現，由CDK1介導SIRT3磷酸化，而SIRT3磷酸化使CPT2脫乙酰化和二聚化，以增強脂肪酸氧化。SHANG W T等[19]報道，UBC基因參與脂肪生成相關PPAR信號通路。在結構上，ERBB2、ERBB3是與ERBB1或ERBB4 相關的共同受體，相關研究[20]報道神經調節因子-1(NRG-1)與ERBB3或ERBB4結合，介導ERBB2受體的活化，進一步激活部分ERKl/2和/或P13K/Akt通路。

藥物治療是除改變生活方式和減重手術以外的一種有潛力的重要療法，本研究分析了針對相應靶點的潛在藥物。文獻檢索結果顯示，氯吡格雷能否治療肥胖癥尚無直接的研究結果，有學者研究了一種可以阻止細胞色素P4508B1作用的減肥藥，而氯吡格雷前體藥物也通過肝臟細胞色素P450酶系統進行代謝[11]。肥胖癥是氯吡格雷治療效果的分層因素, BMI顯著影響CYP2C19基因與氯吡格雷-阿司匹林治療效果之間的相關性[21]。基于小鼠模型的研究[22]發現，由于與白細胞介素-1(IL-1)受體信號相關的前藥生物活性降低，氯吡格雷的抗血小板作用可能在糖尿病患者中受損。氯吡格雷為經典的抗血小板藥物，但相關臨床研究并未提供用藥后BMI變化數據。

脂肪生成和代謝也被認為是肥胖癥的潛在治療靶點。載脂蛋白A-Ⅰ是高密度脂蛋白顆粒的主要蛋白，而香豆素分子結構的類似天然化合物可能有助于增加載脂蛋白A-Ⅰ轉錄的分子成份[23]。依折米貝通過AMPK-mTORC1途徑下調脂質生成相關基因，減少脂質積累，還通過阻滯細胞周期在G0/G1期，抑制脂肪細胞增殖，阻止有絲分裂克隆擴增[24]。依折米貝治療可誘導脂肪細胞中的抗炎細胞因子和脂肪酸氧化，降低血清游離脂肪酸水平，減小內臟脂肪中脂肪細胞大小，并部分改善血糖指數[25]。脂肪組織通過上調PI3K/Akt通路分子來影響內臟前脂肪細胞/脂肪細胞中的胰島素信號傳導[26]。PI3K抑制劑渥曼青霉素被細胞實驗證明可以降低p-Akt、p-FoxO1和PPARγ2的表達，從而抑制人脂肪來源間充質干細胞(hADSC)的脂肪生成[26]。

腸道菌群在肥胖的發生發展過程中發揮重要作用。一項分析依澤米貝對新疆地區超重和肥胖伴血脂異常患者腸道微生物群影響的研究[27]結果顯示，梭狀芽孢桿菌和毛螺菌在依澤米貝干預2周后與總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)均呈負相關，提示其作為潛在的微生物靶點在改善肥胖患者糖脂代謝中的作用。除了受藥物影響外，腸道菌群還受幽門螺桿菌(Hp)的影響，而后者會引發代謝紊亂[28]。研究[29]顯示，根除Hp治療可改善脂代謝和腸道菌群。減重手術切除了部分胃底，可減少Hp感染所致的食欲調節激素[30], 而質子泵抑制劑也可產生根治Hp的效果。左氧氟沙星聯合阿莫西林、質子泵抑制劑的治療方案，根除Hp的效果與一線治療方案(質子泵抑制劑、鉍、甲硝唑、四環素)類似[31]。因此，左氧氟沙星可能通過根除Hp而間接參與肥胖癥的治療。

本研究存在一些局限性: ① 本研究以GEO公共芯片數據為分析基礎，信號通路以及藥物預測結果還需通過臨床樣本和實驗加以驗證; ② 氯吡格雷在心腦血管領域已有很多臨床試驗項目，部分項目包括用藥前的BMI數據，但均未關注用藥后的BMI數據，未來應關注氯吡格雷相關大型臨床研究項目的用藥后BMI數據; ③ 本研究所用開放數據庫的病例源自西方人群，肥胖癥的一些影響因素例如遺傳、表觀遺傳、腸道菌群、生活習慣和經濟狀況等可能與東方人群存在差異。

綜上所述，與RYGB術前相比，肥胖癥患者RYGB術后的肌肉組織基因表達存在顯著差異，這些差異可能成為治療肥胖癥的潛在藥物靶點。肥胖癥疾病過程中的一些關鍵靶點基因，可為治療藥物的研究提供參考依據，但這些基因的臨床價值還需進一步結合臨床病例加以驗證，從而為安全有效地治療肥胖癥提供新思路。