基于二維高效液相色譜法測定兩性霉素B血藥濃度

普琳梅, 張紅燕, 陳興瓊, 陳石芬, 倪媛媛, 宋 賢

(云南省傳染病醫院 藥劑科, 云南 昆明, 650103)

兩性霉素B是一種多烯類抗真菌藥物，具有抗菌作用較強、抗菌譜較廣及藥物相互作用較少的優勢，是艾滋病合并真菌感染的一線用藥，也是危及生命的侵襲性真菌感染和出現三唑類、棘白菌素類藥物耐藥的重癥復雜基礎疾病患者的重要選擇[1-3]。然而，兩性霉素B具有腎毒性、肝毒性和血液系統毒性等[4], 使得其臨床應用受到限制。治療藥物監測(TDM)可為臨床抗真菌治療方案的優化提供科學依據，從而改善藥物治療效果，預防與藥物相關的毒性反應，并減少抗真菌藥物耐藥情況的發生[5]。因此，應用兩性霉素B治療真菌感染患者時，開展TDM是非常必要的。目前，兩性霉素B的血藥濃度監測方法主要為高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜串聯質譜法[6-7], 其中質譜法具有較高的靈敏度，但成本高，推廣難度大，而傳統HPLC樣品前處理操作復雜，色譜柱容易被血漿內源性物質堵塞，內標物不易購買，檢測時間較長，且易出現干擾峰和保留時間漂移情況，不利于臨床常規開展兩性霉素B的TDM[8-9]。隨著檢測技術的發展，二維高效液相色譜法(2D-HPLC)已被廣泛應用于復雜樣本的分離，并被逐漸應用于血藥濃度的監測中[10]。本研究基于2D-HPLC建立兩性霉素B的血藥濃度測定方法，以期為臨床常規開展兩性霉素B血藥濃度監測提供簡便、快速、準確的方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

2D-HPLC系統由FLC2801全自動二維液相色譜耦合儀(湖南德米特儀器有限公司)和島津LC-30A液相色譜部件構成。FLC2801全自動二維液相色譜耦合儀通過微流控系統將色譜泵、檢測器、進樣器等色譜部件耦合在一起，構成第一維液相色譜系統(LC1)與第二維液相色譜系統(LC2), 被分析物質通過FLC2801微流控系統從LC1轉移至LC2, 完成待測樣本的分析，工作站為LC Solution工作站，具體結構見圖1; HR-200電子分析天平(AND, 日本); MINI-15K高速離心機(奧盛，中國); XW-80A漩渦混合器(琪特，中國)。

LC1: 第一維液相色譜系統(1: 第一維色譜泵; 2: 進樣器; 3: 第一維色譜柱; 4: 廢液收集器); LC2: 第二維液相色譜系統(5: 第二維色譜泵; 6: 第二維色譜柱; 7: 二級管陣列檢測器); TRS: 捕獲柱轉移系統(8: 捕獲柱)。圖1 FLC2801全自動二維高效液相色譜系統結構

1.2 藥品與試劑

兩性霉素B對照品(中國食品藥品檢定研究所，批號130628-201501); 甲醇、乙腈、異丙醇(色譜純)，磷酸、磷酸氫二銨、氨水、高氯酸、乙二醇(分析純)，水為雙重蒸餾去離子水(純水儀所制，不低于GB17323執行標準)。空白血漿和患者血漿均由云南省傳染病醫院臨床科室提供。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件: 第一維色譜柱為 Aston SX1色譜柱(3.5 mm×25.0 mm, 5.0 μm), 流動相V甲醇∶V乙腈∶V水(25 mmoL/L磷酸銨鹽水溶液)=1∶3∶3, 流速0.7 mL/min; 第二維色譜柱為Aston SCB色譜柱(4.6 mm×125.0 mm, 5.0 μm), 流動相V水(25 mmol/L磷酸銨鹽水溶液)∶V水(1.0 mmol/L磷酸氫二銨溶液)∶V甲醇∶V乙腈=10∶35∶10∶45, 流速1.0 mL/min; 中間柱為Aston SCB色譜柱(4.6 mm×10.0 mm, 3.5 μm), 輔助流動相為純水。樣本檢測波長380 nm, 柱溫40 ℃, 進樣體積300 μL, 檢測流程見表1。

表1 系統各工序的工作時間段與工作流程

1.3.2 對照品溶液配制: 精密稱取兩性霉素B對照品3.48 mg, 用水溶解并定容至25 mL, 配制成濃度為123.2 μg/mL的兩性霉素B對照品溶液，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.3 血漿樣品處理: 將血漿樣品以3 000轉/min低速離心5 min, 精密吸取血漿樣品400 μL至2 mL EP管中，加入乙腈去蛋白劑1 000 μL, 渦旋振蕩1 min, 再以14 500轉/min高速離心8 min, 然后取上層清液1 000 μL至進樣瓶中待測，進樣量為300 μL, 采用外標工作曲線法進行定量分析。

2 結 果

2.1 專屬性考察

取人空白血漿、兩性霉素B對照品加人空白血漿、患者血漿、兩性霉素B對照品按“1.3.3”方法進行前處理后，按“1.3.1”色譜條件進行分析。色譜圖結果顯示，兩性霉素B保留時間約為6.39 min, 人空白血漿色譜圖在目標峰處未發現干擾，血漿內源性物質和及其他雜質已完全分離，不影響樣本的含量測定，見圖2。

2.2 線性范圍和定量限

取質量濃度為123.2 μg/mL的兩性霉素B對照品溶液，分別用人空白血漿稀釋成系列濃度(0.06、0.32、0.79、2.14、4.92、12.31 μg/mL), 按照“1.3.3”方法處理，并按照“1.3.1”色譜條件進行測定。以兩性霉素B的峰面積(Y)對兩性霉素B濃度(X)進行線性回歸，結果顯示，兩性霉素B濃度為0.059～12.31 μg/mL時，與峰面積呈良好的線性關系，其回歸方程為Y=683 050X+0(r=0.999 9)。兩性霉素B的最低定量限為0.04 μg/mL[信噪比(S/N)>10, 相對標準偏差(RSD)<5.00%], 檢測限為0.01 μg/mL(S/N=3,RSD<10.00%), 完全滿足兩性霉素B血藥濃度臨床檢測要求，見表2。

A: 人空白血漿; B: 人空白血漿+兩性霉素B對照品; C: 患者血漿; D: 兩性霉素B對照品。圖2 兩性霉素B的二維高效液相色譜圖

表2 兩性霉素B的最低定量限和檢測限

2.3 回收率和精密度

取兩性霉素B標準溶液，用人空白血漿將其稀釋成高、中、低濃度(0.40、2.00、8.00 μg/mL)的質控樣品，進行方法學準確度和精密度檢測。每個濃度梯度設置5個平行組，計算實際濃度，比較實際濃度與理論濃度后得出方法回收率和變異系數，檢驗準確度和日內精密度。連續3 d用同樣的方法配制并檢測質控樣品，評估檢測方法的日間精密度。結果顯示，本研究建立的兩性霉素B檢測方法回收率為98.79%～99.39%(RSD<3.00%), 提取回收率為98.50%～99.00%(RSD<3.00%), 日內精密度、日間精密度RSD均<3.00%, 表明本法符合臨床血藥濃度監測的方法學要求，見表3。

表3 兩性霉素B檢測方法的回收率和精密度

2.4 轉移穩定性試驗

2D-HPLC系統將目標物從LC1轉移至LC2的準確性和穩定性用轉移回收率表示，將濃度為25 μg/mL的對照母液按照“1.3.1”色譜條件進行測定，進樣體積為10 μL, 將得到的峰面積與LC2模式下單獨通過分析柱所得峰面積進行比較，設置5個平行組，計算轉移回收率為99.96%,RSD為0.33%, 說明2D-HPLC系統的轉移回收率高且穩定。

2.5 穩定性試驗

取高、中、低濃度的兩性霉素B質控溶液各5份，不同處理(室溫放置24 h, 按照“1.3.3”質控預處理后放置24 h, -80 ℃冷凍保存10 d, 反復凍融3次取出復溫)后，按“1.3.1”色譜條件進行測定。結果顯示，兩性霉素B的RSD均<4.00%, 準確度為97.50%～103.50%, 表明室溫放置24 h、預處理后室溫放置24 h、冷凍10 d和反復凍融3次對兩性霉素B的測定結果均無影響，滿足臨床血藥濃度監測要求，見表4、表5。

表4 室溫放置24 h和預處理后室溫放置24 h的穩定性試驗結果

表5 反復凍融3次和-80 ℃保存10 d的穩定性試驗結果

2.6 臨床樣本檢測

選取云南省傳染病醫院接受注射用兩性霉素B治療的真菌感染患者共計25例，給予維持劑量(15～30 mg/d)的兩性霉素B治療5 d后，于下次給藥前半小時采集患者靜脈血，按“1.3.3”方法處理樣本，并按“1.3.1”色譜條件進行分析。結果顯示，兩性霉素B靜脈維持劑量為15～30 mg/d時，患者血漿谷濃度范圍為0.15～1.03 μg/mL, 見表6。

表6 25例真菌感染患者兩性霉素B血藥濃度監測結果

3 討 論

相關研究[7, 11]顯示，兩性霉素B在某些劑量下存在明顯的變異性，具有不可預測的非線性藥代動力學特點，因此有必要開展TDM。目前，兩性霉素B的TDM多在特殊人群中開展，如免疫缺陷患者、重癥感染患者、腎功能不全患者和兒童患者等[6-7], 同時也適用于對治療劑量(已知病原體對抗菌藥物的敏感性)反應不佳的患者[5]。對于選用兩性霉素B治療真菌感染的患者而言，開展TDM是非常必要的，可指導個性化給藥，改善治療效果。

2D-HPLC檢測系統具有在線凈化除雜功能，二維色譜柱可自動化完成樣本的富集和凈化，避免傳統HPLC測定中因儀器靈敏度和色譜柱分離度的限制而需進行繁雜前處理輔助樣本富集的操作，可提高樣本檢測的準確性和報告的及時性[12-14]。本研究建立的2D-HPLC兩性霉素B測

定方法是將分離機理不同且互相獨立的兩支色譜柱以串聯方式組合，并以自動化的中間柱作為兩支色譜柱的轉移接口。與傳統HPLC相比, 2D-HPLC能顯著減少復雜樣本基質效應和殘留現象，大大提高樣本分離效率，節省檢測時間及監測成本等。本研究2D-HPLC系統的檢測器為高靈敏度二極管陣列檢測器，光程長達85 mm, 可得到任意波長的色譜圖，與HPLC的單通道檢測波長相比，本方法可通過雙通道波長測定濃度的比值來判斷干擾情況。

由于抗真菌藥物種類有限和真菌耐藥性的發展，目前，真菌感染仍是嚴重威脅公共健康的疾病之一[15]。兩性霉素B是抗真菌治療指南推薦的一線治療藥物[16], 開展TDM可優化兩性霉素B治療真菌感染的管理措施[17], 實現個體化給藥，在最大程度提高抗真菌效力與最小化藥物相關毒性方面達到平衡，從而提高臨床治療效果和藥學服務質量。本研究建立的2D-HPLC兩性霉素B血藥濃度測定法具有靈敏度高、重現性好、自動化程度高、樣品處理簡單等特點，適用于臨床患者的兩性霉素B血藥濃度檢測，也為實驗室開展相關的藥物代謝動力學研究提供了一種穩定而可靠的方法。