轉谷氨酰胺酶交聯時間對玉米胚芽蛋白功能性質的影響

王韻儀，任 健，宋春麗，孫天穎，宋 俊，曹 智

(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

玉米胚芽蛋白由玉米胚芽榨油后的副產物玉米胚芽粕中提取而來，主要由水溶性白蛋白和鹽溶性球蛋白組成[1]，含有8種人體必需氨基酸[2]，還具備嬰幼兒所必需的組氨酸，氨基酸含量均衡，營養價值較高。玉米胚芽蛋白具有良好的起泡、增稠和乳化能力，被廣泛用于食品和非食品領域[3-4]。此外，玉米胚芽蛋白還可作為食物補充劑，應用于烘焙制品、肉制品中以補充營養[5]。由于制油過程中的高溫高壓環境導致玉米胚芽蛋白嚴重變性，通常具有低溶解度和難聞氣味兩種缺陷，限制了玉米胚芽蛋白進一步應用的潛力[6]，因此有必要對玉米胚芽蛋白進行改性研究。目前，對于玉米胚芽蛋白提取的研究較多，而對于玉米胚芽蛋白改性的研究還有所缺乏。

酶法改性是利用酶催化蛋白質水解或交聯，從而改變蛋白質的結構和特性。酶法交聯是改造蛋白質組成及結構、易于調控其功能性質的高效方法，也是近年來相關研究的焦點。轉谷氨酰胺酶(TGase)是一種可以催化蛋白質(或多肽)分子之間發生共價交聯的酰基轉移酶，可使蛋白質分子間和分子內生成ε-(γ-谷氨酰基)賴氨酸異肽鍵[7]。轉谷氨酰胺酶促交聯可以改善蛋白質穩定性、溶解性、持水能力、流變學特性、起泡性和乳化性[8-12]。利用轉谷氨酰胺酶對玉米胚芽蛋白進行交聯改性，以期解決玉米胚芽蛋白溶解性低的問題，提高其在食品工業領域的實際應用。為此，本文以玉米胚芽蛋白為原料，利用轉谷氨酰胺酶進行交聯處理，通過對不同交聯時間的玉米胚芽蛋白功能性質及結構表征分析，深入研究結構變化對其性質的影響，分析其可能的作用機制，以期為玉米胚芽蛋白改性提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

玉米胚芽餅，市售；轉谷氨酰胺酶(酶活100 U/g)，江蘇一鳴精細化工有限公司；堿性蛋白酶(酶活2萬 U/g)，諾維信有限公司；石油醚，天津市天力化學試劑有限公司；磷酸二氫鈉，天津市科密歐化學試劑有限公司；所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

ZNCL-GS型酸度計，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Spectrum One傅里葉變換紅外光譜儀，美國PE公司；Nano-ZS90型粒度分析儀，英國Malvern公司；FW80型萬能粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米胚芽蛋白的提取

參考文獻[13-15]采用堿溶酸沉法提取玉米胚芽蛋白。將玉米胚芽餅用磨粉機磨粉6～7次，然后與石油醚按1∶5比例混合浸提3次(每次2 h)進行脫脂，烘干后過0.15 mm(100目)篩，得到脫脂玉米胚芽粕粉。按料液比1∶20向脫脂玉米胚芽粕粉中加入蒸餾水，水浴加熱至50℃后加0.08 mol/L NaOH溶液調pH至8.5，磁力攪拌2 h，于4 000 r/min離心10 min，取上清液用1 mol/L HCl調節上清液的pH至4.7，以4 000 r/min離心10 min，取沉淀，加入10倍質量的預先用1 mol/L HCl調節pH至 4.7的去離子水進行洗滌，以4 000 r/min離心10 min，重復3次，取沉淀；加NaOH溶液調節沉淀的pH至7，然后冷凍干燥24 h，即得玉米胚芽蛋白，記為原樣。

1.2.2 不同交聯時間玉米胚芽蛋白樣品制備

配制5%的玉米胚芽蛋白溶液，調節溶液pH至10，并加熱到45℃，按50 U/g(以玉米胚芽蛋白的質量計)加入堿性蛋白酶，反應3 h，得到酶解物溶液，經冷凍干燥，即得玉米胚芽蛋白酶解物，記為酶解樣。將按上述方法制備的玉米胚芽蛋白酶解物溶液置于37℃的恒溫水浴振蕩器中，按10 U/g(以玉米胚芽蛋白的質量計)加入TGase，分別振蕩反應1、2、3 h，置于90℃水浴鍋滅酶5 min，冷卻至室溫后倒入凍干杯，冷凍干燥、研磨后得到不同交聯時間的玉米胚芽蛋白。

1.2.3 紅外光譜測定

采用傅里葉變換紅外光譜儀對蛋白樣品分子結構進行表征，掃描范圍500～4 000 cm-1。使用peakfit軟件擬合樣品的特征峰，通過特征峰位置和面積分析蛋白二級結構α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲的含量。

1.2.4 粒徑分布和Zeta電位測定

參考文獻[16]的方法，將樣品配制為0.1 mg/mL的蛋白質分散液，用0.22 μm水膜過濾后，用粒度分析儀測定粒徑分布和Zeta電位。

1.2.5 溶解性測定

參考文獻[15]的方法，分別取0.125 g樣品于6只干凈的燒杯中，分別加入25 mL去離子水，用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調節溶液的pH分別至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，將燒杯放入水浴搖床振蕩30 min，然后在3 000 r/min下離心20 min，取上清液，測定280 nm處的吸光度，當吸光度大于0.8時，稀釋相應倍數并重新測定吸光度，空白對照液為去離子水。以吸光度表征樣品的溶解性，吸光度越大，溶解度越大，溶解性越強。

1.2.6 起泡性測定

參考文獻[17]的方法，用磷酸鹽緩沖液配制蛋白質質量濃度為1 g/L的樣品溶液，取100 mL蛋白溶液于250 mL燒杯中，測量樣品體積(VL)，用高速組織攪拌機以12 000 r/min均質1 min，記錄攪打剛停止時的泡沫體積(V0)，以及攪打后靜置30 min時的泡沫體積(V30)。按下式計算樣品的起泡能力(FC)和泡沫穩定性(FS)。

FC=V0/VL×100%

(1)

FS=V30/V0×100%

(2)

1.2.7 持水性和持油性測定

參考文獻[18]的方法測定持水性。向干燥的離心管(質量記為m1)中加入0.200 0 g干燥至恒重的蛋白樣品(質量記為m0)，加入10 mL蒸餾水，攪拌使蛋白樣品與蒸餾水充分混勻，然后在5 000 r/min下離心30 min，緩慢倒出上清液，稱量離心管與沉淀的質量(質量記為m2)。按下式計算持水性(CW)。

CW=(m2-m1-m0)/m0

(3)

參考文獻[18]的方法測定持油性。向干燥的離心管中加入0.2 g蛋白樣品(樣品質量為m)，再加入10 mL大豆油(體積記為V1)，攪拌使蛋白樣品與大豆油充分混合，然后在5 000 r/min下離心30 min，將上清液緩慢倒入量筒中，記錄其體積(體積記為V2)。按下式計算持油性(Co)。

Co=(V1-V2)/m

(4)

1.2.8 乳化性測定

參考文獻[19]的方法，以0.1 mol/L磷酸鹽溶液為溶劑配制質量濃度為1 g/L的蛋白樣品溶液，加入大豆油(大豆油與蛋白質溶液體積比1∶3)，然后用均質機以12 000 r/min均質1 min。取50 μL上清液，加入5 mL 1 g/L的十二烷基磺酸鈉溶液，測定500 nm處的吸光度(A0)。再取均質靜置10 min后的上清液重復上述操作。按下式計算乳化活性和乳化穩定性。

(5)

IES=A10/A0×100%

(6)

式中：IEA為乳化活性，m2/g；φ為樣品溶液油的體積分數；c為乳化前蛋白樣品溶液的質量濃度，g/mL；n為稀釋倍數；IES為乳化穩定性；A10為乳液靜置10 min后的吸光度。

2 結果與分析

2.1 交聯時間對玉米胚芽蛋白二級結構的影響

玉米胚芽蛋白的紅外光譜圖如圖1所示，二級結構含量如表1所示。

圖1 玉米胚芽蛋白紅外光譜圖

表1 玉米胚芽蛋白二級結構含量 %

由圖1可見：在3 300～3 600 cm-1的衍射峰對應O—H的伸縮振動[20]，各組樣品均出現氫鍵的特征峰，而3 350 cm-1和3 188 cm-1處的雙峰則對應N—H的反對稱與對稱伸縮振動吸收峰[21]；經過TGase交聯后的玉米胚芽蛋白的最大吸收峰值較原樣發生偏移，表明蛋白質氫鍵發生改變且O—H和N—H含量發生變化；2 880～2 990 cm-1處的衍射峰對應C—H伸縮振動，隨著交聯時間的延長該處峰面積增大，表明隨著交聯時間的延長，蛋白質的主側鏈碳基結構發生變化；在TGase交聯3 h后，在酰胺Ⅰ帶范圍內(1 600～1 700 cm-1)，玉米胚芽蛋白的特征峰(1 658 cm-1)相對于酶解樣的特征峰(1 653 cm-1)藍移了5 cm-1。

由表1可見，玉米胚芽蛋白被堿性蛋白酶酶解后，二級結構中除無規則卷曲增加外，其他變化不顯著，因為酶解主要改變蛋白質一級結構，而對玉米胚芽蛋白的二級結構影響程度較小。隨著TGase交聯的進行，β-折疊含量在前1 h內升高隨后下降，α-螺旋和β-轉角含量的趨勢正好相反，無規則卷曲的含量則在前2 h內基本穩定，在3 h時突然增加，可能受蛋白質聚集影響，使蛋白質由有序結構向無序結構轉變。

2.2 交聯時間對玉米胚芽蛋白粒徑的影響(見圖2)

圖2 交聯時間對玉米胚芽蛋白粒徑的影響

由圖2可見，隨著交聯時間的延長，玉米胚芽蛋白的粒徑發生了變化，原樣、酶解樣、交聯1 h、交聯2 h和交聯3 h的樣品的平均粒徑分別為138.1、116.5、121.3、125.5、138.2 nm。經堿性蛋白酶酶解后玉米胚芽蛋白的粒徑減小，是由于蛋白質分子鏈斷裂所致；隨著TGase交聯時間的延長，玉米胚芽蛋白粒徑逐漸增大，是由于TGase的作用使得經過酶解后的部分蛋白質分子發生再聚集，形成體積較大的聚合體，聚合體數量隨交聯時間的延長而增多，從而使粒徑增大。另外，各樣品的峰值所對應粒徑的大小，也呈現相同的變化趨勢。

2.3 交聯時間對玉米胚芽蛋白Zeta電位的影響(見圖3)

圖3 交聯時間對玉米胚芽蛋白Zeta電位的影響

Zeta電位絕對值大小反映蛋白質表面的靜電排斥強弱，Zeta電位絕對值越大，靜電排斥作用越強，分子間越不易聚集[22]。由圖3可見，酶解后Zeta電位絕對值增加，這是因為酶解促使蛋白質內部帶負電荷的氨基酸殘基暴露[23]。TGase交聯后Zeta電位絕對值小于酶解后的玉米胚芽蛋白。隨著TGase交聯時間的延長，Zeta電位絕對值先增大后減小，交聯2 h時，Zeta電位絕對值最大。這是因為在交聯前期，TGase交聯會使谷氨酰胺與賴氨酸形成異肽鍵，導致氨基丟失，減少正電荷數，使Zeta電位絕對值增加；在交聯后期，反應體系中沒有賴氨酸殘基或伯胺時，水作為酰基受體與谷氨酰胺殘基發生水解，脫除帶負電的酰胺基團，從而減少了Zeta電位絕對值[24]。

2.4 交聯時間對玉米胚芽蛋白溶解性的影響(見圖4)

圖4 交聯時間對玉米胚芽蛋白溶解性的影響

由圖4可見：隨著pH的升高，各樣品的溶解度呈先下降后上升的趨勢，酶解樣的溶解度在各pH均最高，這是因為經堿性蛋白酶酶解后蛋白質分子鏈變短，有利于蛋白質溶解；在pH為4時各樣品的溶解度均表現為最低值，這是因為此時蛋白質接近電中性，分子間靜電斥力減弱，因此溶解度最低[25]；隨著交聯時間的延長，玉米胚芽蛋白的溶解性逐漸增強，交聯3 h的玉米胚芽蛋白溶解性最強，這是因為TGase可以催化谷氨酰胺殘基與賴氨酸形成分子內和分子間的異肽鍵，降低球蛋白表面的疏水性，從而提高溶解性，另外，β-轉角含量升高也會降低蛋白質的表面疏水性，提高蛋白質的溶解性[26-27]。

2.5 交聯時間對玉米胚芽蛋白起泡性的影響(見圖5)

圖5 交聯時間對玉米胚芽蛋白起泡性的影響

由圖5可見，隨著交聯時間的延長，玉米胚芽蛋白的起泡能力呈上升趨勢，交聯3 h時，起泡能力最強，為175%，顯著高于其他樣品(p<0.05)，說明TGase處理玉米胚芽蛋白可提高其起泡能力，且可通過交聯時間的長短來調控。這是因為隨著TGase交聯時間的延長，玉米胚芽蛋白肽鏈上谷氨酰胺與氨基酸殘基相連，形成高機械強度網狀液膜，膜的彈性及致密性提高，氣體不易向外擴散，從而使起泡能力增強[28]。隨著交聯時間的延長，玉米胚芽蛋白泡沫穩定性先上升后下降，原樣、酶解樣和交聯1 h的樣品泡沫穩定性差異不顯著(p>0.05)，交聯2 h的樣品泡沫穩定性最強(90.6%)，交聯3 h時樣品的泡沫穩定性減弱。雖然玉米胚芽蛋白發生交聯反應形成了較大的聚合物，有利于泡沫的形成和吸附，導致起泡能力增強，但TGase交聯3 h的樣品Zeta電位絕對值變小，分子間易于聚集，導致泡沫坍塌，影響泡沫的穩定性[29-31]。

2.6 交聯時間對玉米胚芽蛋白持水性和持油性的影響(見圖6)

圖6 交聯時間對玉米胚芽蛋白持水性和持油性的影響

由圖6可見，玉米胚芽蛋白經堿性蛋白酶酶解和TGase交聯反應后，持水性和持油性均有所增強，并且持水性隨著交聯時間的延長而提高，交聯3 h時持水性達到了3.90 g/g，較原樣提高了9.16%，其原因可能是堿性蛋白酶的脫酰胺導致蛋白質的二級結構發生變化，更多的親水肽鏈暴露，經TGase處理后形成了新的化學鍵，增強了蛋白質的網狀結構，為水分子的留存提供了空間，兩者協同提高了玉米胚芽蛋白的持水性[31]。結合蛋白質二級結構的變化規律，推測β-折疊向β-轉角的轉變可能會促進玉米胚芽蛋白網狀結構的形成。交聯3 h 時玉米胚芽蛋白的持油性表現為最高值(3.81 mL/g)，較原樣提高了8.71%，且顯著高于其他樣品(p<0.05)，但在0～2 h的交聯時間內，持油性增長緩慢，歸因于TGase交聯反應初期的肽鏈解離，形成的聚合物較少，而油分子較大，蛋白質結構不能良好地支撐油分子，隨著交聯時間的延長聚合物增多，蛋白質空間結構變密，相對分子質量變大，有利于俘獲和支撐油分子[32]。

2.7 交聯時間對玉米胚芽蛋白乳化性的影響(見圖7)

圖7 交聯時間對玉米胚芽蛋白乳化性的影響

由圖7可見，堿性蛋白酶酶解后玉米胚芽蛋白的乳化活性(3.315 m2/g)比原樣(1.973 m2/g)有所增加，這是由于酶解后玉米胚芽蛋白的分子鏈變短，暴露出極性基團使其乳化活性稍有改善。經堿性蛋白酶酶解后的玉米胚芽蛋白乳化穩定性最高(42.01%)，這是因為酶解后蛋白質相對分子質量較小，溶解性最好，Zeta電位絕對值最高，所以其乳化穩定性最強。隨著交聯時間的延長，玉米胚芽蛋白的乳化活性逐漸升高，交聯3 h的玉米胚芽蛋白乳化活性較原樣提高了16.7倍，并且也顯著高于其他樣品(p<0.05)。這是因為經過TGase交聯的蛋白質小分子發生聚集，形成了更多的網狀結構，增強了水油界面的吸附性，同時更大的蛋白質粒徑也有助于形成更大粒徑的乳液，從而提高了乳化活性[33]；其次，隨交聯時間延長蛋白質羥基增多，其二級結構的改變造成了其溶解性和疏水性的改變，疏水性的降低可能是由于聚合肽暴露的疏水殘基被埋在聚合分子內部，蛋白質親水基團增多利于其在水油界面上的吸附，從而提高了乳化活性[34-35]。玉米胚芽蛋白乳化穩定性則隨著TGase交聯時間的延長而降低，這可能是由于交聯形成的聚合物增多導致相對分子質量增大，蛋白質之間易于團聚所導致。

3 結 論

對TGase交聯玉米胚芽蛋白功能和結構性質進行檢測表征，結果表明，與原樣相比，TGase交聯處理可以增強玉米胚芽蛋白的溶解性、起泡能力、持水性、持油性和乳化活性，除持油性外，與交聯時間均呈正相關的趨勢，綜合來說，交聯3 h的玉米胚芽蛋白的功能性質表現最佳。交聯處理后蛋白質中β-轉角二級結構和羥基增多，蛋白質的粒徑大小和Zeta電位發生了改變，蛋白質結構與表面化學性質的變化共同影響著玉米胚芽蛋白的功能性質。