基因工程技術生產重組膠原蛋白分析

黃嘉文

（廣州美神生物科技有限公司，廣東廣州 510670）

膠原蛋白約占人體總蛋白的28%，屬于人體分布最為廣泛的功能性蛋白，其具有良好穩定性，備受相關產業關注，但膠原蛋白結構復雜且類型多樣，故在分離提取與生產重組中存在一定困難。隨著科技的不斷進步，可運用基因工程技術進行膠原蛋白的生產重組，在先進技術驅動下，重組膠原蛋白生產量有所提升，對于膠原蛋白的生產重組開發研究項目逐漸推進。

1 膠原蛋白結構分析

膠原蛋白由多個原膠原構成，各原膠原均由三條α-螺旋肽鏈組成，各肽鏈長約一千個氨基酸殘基，三條α-螺旋肽鏈纏繞而形成了三重螺旋結構[1]。膠原左旋α鏈僅螺旋纏繞構成的復合螺旋結構被稱為螺旋區段，其最大特征在于周期性排列。在膠原蛋白結構中，羥脯氨酸、脯氨酸占比最高，可達25%，此外，羥基賴氨酸僅存在于膠原蛋白結構中，其他蛋白質均不含有羥基賴氨酸，且羥基賴氨酸無法參與生物合成，僅可從膠原肽鏈中轉化獲取。

2 膠原蛋白借助基因工程技術實現生產重組的方向

動物膠原蛋白存在不穩定性，且具有一定風險，為切實發揮出膠原蛋白的優勢，主要探究基因工程技術生產重組人膠原蛋白的方式。現階段基因工程技術在實際應用中，主要將轉基因動植物、酵母、細菌、昆蟲細胞作為宿主細胞進行人膠原蛋白的生產重組，可獲得質量穩定、安全性好的膠原蛋白產品，解決了傳統辦法所存在的病毒隱患及免疫排異性問題。

2.1 動植物生產重組

將αS1-乳腺酪蛋白基因片段及膠原蛋白基因片段進行基因工程重組，以轉基因鼠乳腺細胞作為宿主細胞，以此可獲得人I型原膠原，在鼠乳三螺旋結構中，同型三聚體質量濃度可達8mg/mL[2]。通過該基因工程技術生產重組方式能夠實現較高產量，但所獲得的膠原蛋白羥脯氨酸含量不達正常水平的一半，結合該結果來看，推測乳腺P4H可對羥基化產生限制，此時可通過P4H轉入編碼降低該限制，從理論上看，可采用該方式獲得大量重組膠原，但該方式并未完全消除安全隱患，故在實踐生產重組中并未采用。

依托于基因工程技術，可應用基因注入辦法進行表達重組，例如：結合轉基因蠶絲腺來看，其長度較短，為1/3的人膠原蛋白長度，且因其絲腺內P4H成分活力較低，無法良好完成羥基化過程，導致膠原蛋白表達重組效果不佳，針對該現象，可依托于基因工程技術，采用基因注入的方式提升絲腺P4H活力，經處理后解決了脯氨酸無法充分羥基化的現象。在基因注入過程中，可將桿狀病毒IE-1注入到絲腺中，通過該操作可提升蠶繭干質量，使蛋白結果能夠直接分泌到蠶絲絲膠層，使膠原蛋白的純化與提取更為便捷。

從植物角度來看，可將人膠原蛋白及P4H對應基因嵌入到煙草植株中，通過該基因工程技術操作，能夠活動完整羥基化地重組膠原蛋白。在上述表達重組過程中，需借助瞬時表達技術完成膠原蛋白的表達重組，使修飾酶能夠在煙草植株中完成表達，以此有效提高重組蛋白質量。除此之外，在現有研究中，現已實現了大麥重組表達重組膠原蛋白。從當前基因工程技術生產重組膠原蛋白產業發展來看，動植物細胞存在成本高、難度高的限制，無法實現規模化膠原蛋白生產，故從產業發展角度來看，宿主細胞選擇微生物較為合適。

2.2 微生物生產重組

在現有研究中，可結合人膠原α1鏈膠原域序列特征提高膠原蛋白表達量，并以此為依據合成親水性良好的重復序列基因單體，進一步采用同向串聯的方式構建人膠原蛋白表達載體，并使其轉化為畢赤酵母，以此完成人膠原蛋白的表達重組。此外，單體同向串聯操作期間能夠按時間需求獲得不同的蛋白基因，且所表達重組膠原蛋白產物能夠良好實現分離純化，同時畢赤酵母生產周期短，從某種程度上降低了生產重組成本。將微生物作為宿主細胞時，可通過酶解工藝、凍干工藝、透析工藝、滅菌工藝制備人膠原蛋白，通過一系列處理可將膠原蛋白質量提升至99.8%，極大降低DNA殘留量，膠原蛋白結構N末端、C末端肽濃度遠低于檢測限度[3]。通過上述工藝操作，對酶解工藝的端肽去除效果進行了驗證，可在人膠原蛋白制備期間大幅降低其免疫原性。

對現有微生物表達重組膠原蛋白進行分析，發現適宜羥基化的膠原蛋白進行生產表達重組時，可將畢赤酵母作為宿主細胞，以此產生人膠原蛋白α1鏈，采用共同表達P4H的方法確保人膠原蛋白α1鏈中含有羥脯氨殘基。為進一步驗證該生產表達重組效果，可應用液相色譜-質譜/質譜分析法，選取重組膠原蛋白進行檢測，以此獲得羥基化脯氨酸表達情況。

膠原蛋白現已被廣泛應用到化妝品、護膚品中，但在于皮膚吸收外用膠原蛋白的有效性方面仍存有一定爭議，若外用膠原蛋白無法被人體皮膚良好吸收，將無法切實發揮出外用膠原蛋白的作用，且可造成一定資源浪費。針對這一問題，可應用基因工程技術生產重組人膠原蛋白，選取皮膚存在激光損傷的小鼠進行修復實驗，以此了解外用膠原蛋白對人體皮膚的效果。在該實驗的前期研究中，結合二次諧波及熒光成像方式，對重組人膠原蛋白皮膚吸收情況進行觀察，通過實驗發現，重組人膠原蛋白能夠沿毛囊逐漸進入皮膚真皮層，同時不斷擴散到達膠原纖維層，借助人膠原蛋白實現人體皮膚膠原纖維的補充。在激光損傷下小鼠皮膚修復實驗中，運用460～510nm的激光照射小鼠皮膚，在其背部造成激光損傷效果，此時將基因工程技術生產重組的人膠原蛋白均勻涂抹至小鼠激光損傷皮膚處，在實際涂抹處理時，運用生理鹽水將人膠原蛋白配置為8mg/mL的劑量，按照每日涂抹一次，連續涂抹14d的修復方案進行涂抹。在人膠原蛋白涂抹后1d、4d、7d、14d進行觀察記錄，為實現精準化修復效果觀察，需借助雙光子顯微鏡檢測小鼠背部激光損傷處的膠原纖維情況，為便于觀察，可進行HE染色，以此直觀化觀察背部激光損傷處的病理學變化[4]。完成上述觀察操作后檢測膠原纖維細胞增殖活力情況，同時對細胞存活率進行計算。將對照組與實驗組損傷處理效果進行對比，發現人膠原蛋白能夠縮小皮膚損傷處的恢復時間，由此可證明，人膠原蛋白能夠被皮膚良好吸收，其作用原理在于提升皮膚成纖維細胞的活力，并促進其增殖。結合上述實驗可見，經基因工程生產重組的人膠原蛋白能夠被皮膚良好吸收，且可對損傷皮膚起到一定修復效果。

3 重組膠原蛋白產品功效分析

STEE HILL溯華重組膠原蛋白緊致彈力套裝由潔面乳、柔膚水、精華乳、精華液、面霜構成，其采用基因工程技術完成的膠原蛋白生產重組工作，為探究基因工程技術在膠原蛋白生產重組中的作用，了解重組基因蛋白在護膚品中的功效，本次選取STEE HILL溯華重組膠原蛋白緊致彈力套裝進行檢測。

3.1 測試概況

本次STEE HILL溯華重組膠原蛋白緊致彈力套裝檢測的主要目的是為驗證產品的抗皺、保濕作用，間接驗證經基因工程技術生產重組膠原蛋白的應用效果，通過驗證相關產品功效而判斷基因工程技術在膠原蛋白生產重組中的作用。在測試期間，需從皮膚角質層水分含量、皮膚皺紋數量、皮膚皺紋面積、皮膚皺紋長度四個方面進行測試，同時采用實驗室專家評估法進行皺紋等級評分，該項評分存在一定主觀性因素，故僅作為參考意見，此外，對受試者（共計31人）自我評估看法進行采集，發現套裝內五款產品均獲得了93.5%以上滿意度，其中潔面乳更是達到了100%滿意。在該次重組膠原蛋白緊致彈力套裝檢測中，發現該套裝產品在使用14d后能夠表現出優異的保濕效果，使用28d后即可表現出良好的除皺效果。

3.2 測試方案

STEE HILL溯華重組膠原蛋白緊致彈力套裝樣品主要作用于時受試者面部，每日早晚各使用一次，連續使用28d。產品的使用方法如下：每日潔面后，按照柔膚水、精華液、精華乳、面霜的順序進行使用。對受試者基本信息進行采集，在本次測試實驗中，受試者共計31人，均為女性，且年齡均處于30～50歲，受試者膚質要求如下：面部松弛、敏感肌膚、有皺紋者，皺紋評分1～3分，其中有8人為1級皺紋等級，15人為2級皺紋等級，10人為3級皺紋等級，角質層水分含量≤60c.u，皮膚彈性R2≤0.2，對受試者情況進行篩選，最終獲得31名有效數據。

3.3 測試結果

從皮膚角質層水分含量來看，與使用樣品前相比，31名受試者在使用樣品14d后，臉頰部位皮膚角質層水分含量提升了5.23%，有顯著性差異；在使用樣品28d后，臉頰部位皮膚角質層水分含量提升了3.88%，無顯著性差異。

從皮膚皺紋數量（見圖1）來看，與使用樣品前相比，31名受試者在使用樣品14d后，眼底部位皺紋數量降低了28.32%，眼角部位皺紋數量降低了26.99%，有顯著性差異；在使用樣品28d后，眼底部位皺紋數量降低了30.11%，眼角部位皺紋數量降低了29.83%，有顯著性差異。

圖1 各時間點皮膚皺紋數量（P＜0.05）

從皮膚皺紋面積（見圖2）來看，與使用樣品前相比，31名受試者在使用樣品14d后，眼底部位皺紋面積降低了10.03%，眼角部位皺紋面積降低了12.032%；有顯著性差異；在使用樣品28d后，眼底部位皺紋面積降低了10.82%，眼角部位皺紋面積降低了14.87%，有顯著性差異。

圖2 各時間點皮膚皺紋面積（P＜0.05）

從皮膚皺紋長度（見圖3）來看，與使用樣品前相比，31名受試者在使用樣品14天后，眼底與眼角的皺紋長度分別降低了11.06%、13.91%，有顯著性差異；使用樣品28天后，眼底與眼角的皺紋長度分別降低了12.28%、16.07%，有顯著性差異。

圖3 各時間點皮膚皺紋長度（P＜0.05）

綜上所述，STEE HILL溯華重組膠原蛋白緊致彈力套裝在使用14d后有保濕效果，在使用28d后有抗皺效果。

4 結束語

基因工程技術的應用極大提高了膠原蛋白生產重組效率，使膠原蛋白能夠實現穩定供應，繼而使其在化妝品、醫藥、生物等領域中發揮實效。動物膠原蛋白具有不穩定性，且存在一定風險，故在當前膠原蛋白生產重組中，多以人膠原蛋白的動植物表達、微生物表達生產重組為主。結合案例重組膠原蛋白護膚品檢測結果來看，該款護膚品在抗皺、保濕方面具有顯著效果，而其功效的實現則是基因工程技術生產重組膠原蛋白的結果。