云南南澗地區致仔豬腹瀉性大腸桿菌血清型鑒定與耐藥性分析

尹忠文

（云南省大理洲南澗縣公郎鎮農業綜合服務中心，云南大理 675701）

仔豬腹瀉病是危害養豬業的主要疾病之一，臨床中以細菌性腹瀉最為常見，如大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、奇異變形桿菌等均可以引起仔豬的腹瀉病，大腸桿菌是引起仔豬腹瀉病最多且最為常見的細菌[1,2]。致病性大腸桿菌可以引起仔豬白痢、仔豬黃痢和仔豬水腫病，其感染和死亡率均較高，尤其是仔豬白痢、仔豬黃痢死亡率高達80%以上，嚴重影響著養豬業的發展[3]。國內相關研究表明大腸桿菌抗原結構復雜，具有多種致病血清型且無交互保護性，無有效疫苗保護，導致大腸桿菌病在不同的地區廣泛發生與流行[4,5]。細菌生物被膜(Bacterial biofilm,BBF)是組成結構性細菌群落的主要物質，且在自然界中能形成生物被膜(Biofilm,BF)，研究表明，細菌的生物被膜形成能力與其毒力及耐藥性有一定相關性[6,7]。仔豬的大腸桿菌病主要用抗生素進行治療，而近年來，由于抗生素的濫用，致使細菌的耐藥性較嚴重，且出現多重耐藥菌株，加大了該病的治療難度，同時耐藥性和藥物殘留也威脅著人類健康[8]。

本試驗采集患腹瀉病仔豬的肛拭子、糞便、肝臟等病料243份進行大腸桿菌分離鑒定，對其流行病學進行檢測，為云南南澗地區大腸桿菌病的防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2018—2020年采集南澗縣豬場的患腹瀉病仔豬的肛拭子、糞便、肝臟等病料243份進行大腸桿菌分離鑒定。

1.2 試驗材料

麥康凱培養基、96孔細菌培養板、大腸桿菌顯色培養基、營養肉湯購自北京雙旋微生物培養基制備科技公司；藥物紙片購自杭州天和微生物制劑有限公司；細菌生化試紙條購自上海研晶生物科技有限公司；大腸桿菌O抗原鑒定因子購于中國食品藥品監察所。

1.3 細菌的分離與培養

將患腹瀉病仔豬的病料組織樣品處理后，無菌條件下接種于麥康凱培養基上進行鑒別培養，37℃恒溫培養18～24 h，挑取單個菌落接種于大腸桿菌顯色培養基上37℃培養12～18 h，挑大腸桿菌顯色培養基上的單個菌落接種于營養肉湯中，純化培養后進行鏡檢和生化試驗。

1.4 致病性試驗

周倩[9]報道的方法，將分離的大腸桿菌菌株接種于LB培養基中進行純化培養，挑取單個菌落放入LB液體培養基搖床37℃150 r/min振蕩培養至濁度與0.5麥氏比濁管(1×108cfu)相同。用培養后的大腸桿菌菌液注射小鼠，按照0.2 mL/10 g菌液進行腹腔注射，對照組注射等量的無菌生理鹽水，試驗期7 d，試驗期間觀察小鼠的采食情況、精神狀態、排泄情況、發病情況等，對死亡的小鼠進行解剖觀察。

1.5 細菌血清型檢測

索慧娜[10]報道，采用玻板凝集試驗對分離的大腸桿菌菌株進行血清型檢測，取制備的大腸桿菌單因子血清3 μL置于干凈載玻片上，在取3 μL大腸桿菌高壓懸液與血清混勻，30～60 s觀察載玻片上液體是否發生反應。若出現明顯凝集則為“陽性反應”，反之則為“陰性反應”。

1.6 細菌的生物被膜檢測

對分離菌株進行被膜形成能力測定，判定標準以陰性對照孔OD值的2倍作為判斷能否形成BF的臨界點ODc，當OD≤ODc時，表示BF形成能力為零；當ODc＜OD≤2×ODc時，表示BF形成的能力較弱；當OD≥2×ODc時，表示生物被膜的形成能力較強。

1.7 藥敏試驗

參照美國生物被膜臨床實驗室標準化協會(CLSI)推薦的標準藥敏試驗法進行操作和試驗結果判斷。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養結果

疑似大腸桿菌分離菌株在LB培養基、大腸桿菌顯色培養基長出的菌落形態及與鏡檢形態學報道的大腸桿菌的培養特性和形態學基本一致。經統計采集的243份樣品中分離到了113株符合大腸桿菌的培養特性和形態學。

2.2 細菌的生化試驗結果

對分離的疑似大腸桿菌的菌株進行生化試驗，結果表明，113株分離株鑒定為大腸桿菌，鑒定結果合格率為99.7%～99.9%。

2.3 致病性檢測結果

攻毒組的小鼠在攻毒后的2～4 d出現發病，且個別小鼠出現急性死亡，剖檢死亡的小鼠腸道有出血，腸黏膜出現脫落；肝臟、脾臟有不同程度的出血，且可分離得到的致病性大腸桿菌。對照組的小鼠健康存活。經統計分離出的113株大腸桿菌中，有87株大腸桿菌對小白鼠具有致病性。

2.4 血清型檢測結果

由表1可知，用玻板凝集試驗對分離的87株致病大腸桿菌進行血清學鑒定。分離出14種不同血清型的大腸桿菌，其中以O38(17.25%)、O101(18.4%)和O142(14.9%)為云南省大理州南澗縣致仔豬腹瀉病的主要流行血清型。

表1 血清型檢測結果

2.5 被膜形成能力結果

分離的87株仔豬源致瀉性大腸桿菌中，強形成被膜能力菌株有24株(27.6%)、中形成被膜能力菌株有34株(39.1%)、弱形成被膜能力菌株有17株(19.5%)、不形成被膜菌株有12株(13.8%)。

2.6 耐藥性分析

由2可知，分離的87株仔豬致瀉性大腸桿菌對阿莫西林、氨芐西林、多西環素、紅霉素、磺胺間甲氧嘧啶、鏈霉素等6種藥物的耐藥率較高，耐藥率在77.0%～98.9%之間；對慶大霉素、多粘菌素、新霉素、大觀霉素等4種藥物的耐藥率在49.4%～65.5%之間；對氟苯尼考、環丙沙星、恩諾沙星、林可霉素、頭孢噻呋、頭孢噻肟等6種藥物的耐藥率在9.2%～28.7%之間。

表2 藥敏試驗結果

3 討論

國內外研究表明，致病性大腸桿菌是引起仔豬腹瀉病的主要病原菌之一，其感染率和死亡率較高，對仔豬的危害較大，嚴重影響養豬業的發展。大腸桿菌為條件性致病菌，廣泛存在于環境中，尤其是衛生條件較差的豬舍，當仔豬受到冷熱等應激時，機體抵抗力下降，極易出現腹瀉病，因此，注意環境衛生及環境的消毒是有效防控大腸桿菌病的重要措施之一[11,12]。關于仔豬腹瀉性大腸桿菌的報道逐漸增多[13-17]，致病性大腸桿菌在我國各個地區廣泛分布與流行，應該做好防控措施，減少該疾病的發生。本試驗從云南南澗地區患腹瀉病的仔豬病料中分離得到了87株致病性大腸桿菌，探明了大腸桿菌在該地區流行的血清型，說明大腸桿菌因感染宿主和區域的不同，菌株血清型也存在一定差異。發現云南南澗地區的大腸桿菌血清型，以O38(17.25%)、O101(18.4%)和O142(14.9%)為主要流行優勢血清型。可以把O38、O101和O142作為研制大腸桿菌多價疫苗的候選菌株，為進一步研究防治該地區的仔豬腹瀉性大腸桿菌疫苗奠定基礎。此外，本試驗發現分離的87株致病性大腸桿菌中以強、中形成被膜能力菌株較多。李金朋等[8]報道了從河南分離的豬源大腸桿菌具有生物被膜形成能力，張召興等[10]報道了河北地區蛋雞源大腸桿菌具有生物被膜形成能力，與本文報道基本一致。

此外，本試驗對大腸桿菌的耐藥性進行了分析，發現分離的87株致病性大腸桿菌對藥物耐藥率在49.4%以上的有10種藥物，分別為阿莫西林、氨芐西林、多西環素、紅霉素、磺胺間甲氧嘧啶、鏈霉素、慶大霉素、多粘菌素、新霉素、大觀霉素。耐藥率在9.2%～28.7%之間的有6中，分別為對氟苯尼考、環丙沙星、恩諾沙星、林可霉素、頭孢噻呋、頭孢噻肟等。說明云南南澗地區流行的仔豬源致瀉性大腸桿菌耐藥性嚴重。

4 結論

本研究對2018—2020年采集的云南南澗地區不同養殖場中患腹瀉病仔豬的肛拭子、糞便、肝臟等病料樣品243份進行了大腸桿菌的培養鑒定，分離得到87株致病性大腸桿菌，以O38、O101和O142為主要流行優勢血清型，以強、中、弱形成膜能力菌株為主，分離菌株對臨床中10種藥物的耐藥率較高，且耐藥性嚴重。為該地區大腸桿菌病的防治提供理論依據。