缺氧缺血性損傷對新生豬腦內鈉鉀ATP酶及CaMKⅡ表達的影響

盧萌，鄭陽，王曉明

（中國醫科大學附屬盛京醫院放射科，沈陽 110004）

缺氧缺血性腦損傷早期可通過自由基的產生激發炎癥或氧化應激反應［1］。缺氧缺血后，活性氧（reactive oxygen species，ROS）迅速增加，過量的ROS直接作用于細胞大分子，導致級聯炎癥反應和蛋白酶分泌。這些衍生物參與了多種途徑（炎癥、凋亡、自噬和壞死）的復雜相互作用，最終導致腦損傷［2］。

神經細胞中鈉鉀ATP酶是維持細胞功能必不可少的跨膜蛋白，直接調節并維持細胞內外Na+、K+離子濃度，間接影響Ca2+、Cl-等離子濃度以維持膜電位，對神經元的信號轉導及調控具有重大意義［3］。鈉鉀ATP酶活性改變是缺氧的最早反應，對細胞存活至關重要［4］。鈉鉀ATP酶還作為細胞信號轉導的受體，激活多種信號通路（鈉鉀ATP酶與Src形成的復合物及其關聯的下游多種通路［5］）介導細胞損傷，并與Beclin-1共同介導神經元凋亡［6］。因此，保持鈉鉀ATP酶活性對于神經元的功能及存活至關重要。有研究［7］表明，CaMKⅡ作為RIP3等的底物介導心肌缺血和氧化應激誘導的心肌壞死。此外CaMKⅡ與瞬時受體電位M7通道、p38、cofflin等共同介導細胞死亡［8］；與鈉鉀ATP酶相似，CaMKⅡ通過Beclin-1介導細胞凋亡［9］。除此之外，研究［10］顯示，腦內CaMKⅡ和N-甲基-D天冬氨酸受體、代謝型谷氨酸受體、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體等共同參與長時程增強效應的過程，影響大腦學習與記憶的功能。因此推測缺氧缺血性腦病中CaMKⅡ對腦內神經元的存活和功能維持發揮重要作用。本研究通過建立新生豬缺氧缺血性腦損傷模型，探討缺氧缺血損傷對新生豬腦內鈉鉀ATP酶、CaMKⅡ表達的影響，旨在為闡明新生兒缺氧缺血性腦損傷后離子轉運的調節機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

28頭3～5日齡雄性約克夏豬由中國醫科大學附屬盛京醫院動物室提供，體質量1～1.5 kg。隨機分為對照組（n=4）及模型組（（n=24）。模型組根據缺血缺氧時間均分成6個亞組：0～2 h組、2～6 h組；6～12 h組、12～24 h組、24～48 h組、48～72 h組，每組4頭。本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2 動物模型制備

動物模型的制備參照本課題組既往研究［11］。

1.2.1 對照組：室溫保持在28～30 ℃，于新生豬臀大肌緩慢注入速眠新注射液（0.6 mL/kg）麻醉。麻醉后觀察新生豬生理狀態，當新生豬活動度明顯減低時，以干凈棉簽輕觸角膜外緣，確定角膜反應遲鈍后，將新生豬以仰臥位固定。首先，在喉鏡引導下以2.5 mm氣管插管對新生豬進行機械通氣，通入100%氧氣，呼吸機通氣參數值設置為呼吸比1 ∶1.5，呼吸頻率30 次/min。監測新生豬的心率和血氧飽和度。固定氣管插管，對新生豬頸前區及周圍皮膚進行消毒，取頸正中切口，逐層分離，將雙側頸總動脈與毗鄰的頸內靜脈、迷走神經分離，40 min后縫合切口。

1.2.2 模型組：麻醉、機械通氣及頸總動脈分離操作與對照組相同。隨后進行缺氧缺血損傷建立：小動脈夾夾閉雙側頸總動脈（注意避開頸動脈竇），阻斷雙側頸動脈血流，與此同時機械通入6%氮氧混合氣，持續40 min。隨后撤去動脈夾，恢復雙側頸動脈血流，機械通氣改為100%氧氣，縫合切口。在新生豬恢復自主呼吸后停止機械通氣，拔出氣管插管。缺氧缺血損傷建立過程中密切監控新生豬生命狀態（血氧、心率等）。若術中發現心率明顯降低或抽搐等預示新生豬生命狀況不良狀況應暫時中斷手術，及時處理。術后將新生豬轉移至35 ℃恒溫箱內。

1.3 免疫熒光染色及圖像處理

對照組在縫合切口后即處死新生豬，模型組各亞組 按照缺氧缺血時間（＞0～2 h、＞2～6 h、＞6～12 h、＞12～24 h、＞24～48 h、＞48～72 h）分別處死新生豬，然后立即取出完整腦組織，置于4%多聚甲醛中固定48 h。將固定后的腦組織冠狀切片（4 mm），然后經脫水、二甲苯透明，石臘包埋后切片（4 μm）。隨后對切片進行鈉鉀ATP酶及CaMKⅡ免疫熒光染色，切片脫蠟后對切片進行3次PBS溶液洗滌，每次5 min，隨后將切片置入微波爐中檸檬酸鹽修復（高火 7.5 min，靜置30 min），取出切片自然冷卻至室溫，再次進行5 min×3次PBS溶液洗滌。擦干切片后山羊血清封閉40 min，完成后甩去多余血清。一抗使用PBS稀釋；切片分組滴加一抗，完成后4 ℃過夜（16 h）；次日取出切片放置30 min使切片恢復至室溫。使用PBS溶液洗滌5 min×3次。避光條件下滴加熒光二抗（1 ∶100），室溫狀態下孵育4 h。PBS溶液洗滌切片5 min×3次。避光條件下滴加含DAPI的封片液，室溫孵育5 min后封片。

每張切片光鏡下（400倍）隨機取相互不重疊的4～6個視野，采用NIKON圖像采集系統照相。細胞染色呈綠色、DAPI核染色為陽性表達（除外血管內血細胞染色），應用Image J進行免疫熒光染色分析，鈉鉀ATP酶、CaMKⅡ的表達采用圖片陽性面積/圖片總面積×100%來表示。表達結果由2位主治醫師共同判定。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 各組鈉鉀ATP酶表達比較

結果顯示，各組均見鈉鉀ATP酶陽性表達，6～12 h組表達水平最低。相鄰各組兩兩比較結果顯示，0～2 h組與2～6 h組（P=0.015）、2～6 h組與6～12 h組（P=0.008）、6～12 h組 與12～24 h組（P＜0.001）、12～24 h組與24～48 h組（P=0.014）鈉鉀ATP酶表達水平比較均有統計學差異。隨著時間的推移，缺氧缺血損傷模型新生豬鈉鉀ATP酶表達呈現先下降后上升然后繼續下降的“橫S型”趨勢。見圖1、表1。

表1 各組鈉鉀ATP酶及CaMKⅡ表達比較Tab.1 Comparison of Na+，K+-ATPase and CaMKⅡ expression in each group

圖1 各組鈉鉀ATP酶免疫熒光染色結果 ×400Fig.1 Results of Na+，K+-ATPase expression in each group by immunofluorescent staining ×400

2.2 各組CaMKⅡ表達水平比較

結果顯示，各組均見CaMKⅡ陽性表達，6～12 h組降至最低水平。0～2 h組與2～6 h組（P=0.012）、2～6 h組與6～12 h組（P＜0.001）、6～12 h組與12～24 h組（P＜0.001）、24～48 h組與48～72 h組（P=0.009）CaMKⅡ表達水平比較均有統計學差異。隨著時間的推移，缺氧缺血模型新生豬CaMKⅡ表達呈“雙谷雙峰”改變，見表1、圖2。

圖2 各組 CaMKⅡ免疫熒光染色結果 ×400Fig.2 Results of CaMKⅡ expression in each group by immunofluorescent staining ×400

鈉鉀ATP酶及CaMKⅡ表達水平均在6～12 h組最低，提示在此段時間內腦損傷最重。

3 討論

研究［12］顯示，神經系統中神經元膜電位的維持至關重要。鈉鉀ATP酶失活則離子轉運失調［13］，可引起膜電位紊亂、細胞腫脹，從而造成神經元功能維持障礙，甚至不可逆地觸發細胞凋亡。本研究結果顯示，缺氧缺血后鈉鉀ATP酶表達不是立即下降至最低，而是在缺氧缺血后6～12 h達到最低。目前腦缺氧缺血損傷治療大多要求在出現缺氧缺血后6 h內進行亞低溫治療［14］，但在腦組織開始出現缺氧缺血到機體表現出缺氧缺血癥狀尚且需要一定時間。本研究結果表明鈉鉀ATP酶表達在缺氧缺血早期未出現明顯下降，如果能在這段時間內發現缺氧缺血并實施治療，則能更好保護神經元功能。因此需要對如何在更細微的層面上做出診斷進行深入研究［15］。

本研究結果顯示，缺氧缺血損傷后12～24 h組鈉鉀ATP酶表達水平較6～12 h組明顯增高（P＜0.05），與對照組鈉鉀ATP酶表達水平未見明顯差異（P＞ 0.05），提示此時細胞功能恢復，其原因可能是此時血氧再灌注、細胞內蛋白質合成增加所致。而后鈉鉀ATP酶表達降低，可能是能量不足以支持高水平的物質合成所致，具體原因尚待進一步研究。鈉鉀ATP酶表達越高則表明細胞活性越高，但是本研究并未區分神經元與神經膠質細胞，無法判斷鈉鉀ATP酶表達升高來自于神經元抑或是膠質細胞，需進一步研究論證。中樞神經系統中可通過不同亞型來區分鈉鉀ATP酶，α2亞型主要在膠質細胞中表達，α3則具有神經特異性［16］。

本研究結果顯示，隨著時間的推移，缺氧缺血腦損傷的新生豬CaMKⅡ表達呈“雙谷雙峰”改變。與對照組比較，缺氧缺血2～6 h 組CaMKⅡ表達增高。CaMKⅡ是多個程序性死亡的節點信號［17］，缺氧缺血損傷后ROS作為損傷因子之一，在Ca2+激活CaMKⅡ之后進一步增加了CaMKⅡ的活性［18］；但同時有研究［19］表明，在缺血再灌注的過程中CaMKⅡ δ亞基的過表達促進了神經元的存活，2～6 h組CaMKⅡ表達呈現出高值，推測是神經元自我保護的表現，可以作為較佳的干預節點。此外，本研究結果顯示，12～48 h 2組CaMKⅡ表達逐漸增加，而在48～72 h組CaMKⅡ表達下降，分析其原因可能是新生豬的喂養條件有限，使新生豬糖分、鹽分及水分攝入不足所致。

有研究［20］表明，不同時段出生（早產、正常）的新生兒血管成熟程度、線粒體功能狀態不同，意味著缺氧缺血時早產兒的血管調節功能不良，同時早產兒和正常新生兒腦血管分布狀況不同，提示應對早產兒進行深入研究。

綜上所述，本研究利用免疫熒光來分析新生豬缺氧缺血腦損傷后不同時間鈉鉀ATP酶及CaMKⅡ的表達，發現鈉鉀ATP酶表達在缺氧缺血腦損傷后6～12 h內最低，隨著時間的推移鈉鉀ATP酶表達呈“橫S型”；CaMKⅡ表達在缺氧缺血腦損傷后2～6 h最高，隨著時間的推移CaMKⅡ表達呈 “雙谷雙峰”樣改變。本研究對明確缺氧缺血性中樞神經損傷后病理改變具有一定意義，但本研究未對新生豬腦進行分區，且樣本量較小，今后應進一步研究論證。