基于網絡藥理學及分子對接探討參苓白術散對慢性腎小球腎炎和抑郁癥異病同治的作用機制

鄭舒文，王柏森，李志明，王圣治

（遼寧中醫藥大學 1.研究生學院，沈陽 110847；2.附屬醫院腎內科，沈陽 110032）

慢性腎小球腎炎（chronic glomerulonephritis，CGN）是我國最常見的慢性腎臟病之一，病程較長者可致慢性腎衰竭，其病理機制尚未明確且無特效藥物［1-2］。抑郁癥主要表現為情緒低落，對周邊事物漠不關心，產生自責心理［3-4］，嚴重影響患者的健康和生活質量［5］，其發病可能與多種因素有關［6-10］。抗抑郁藥治療在短期具有一定作用，但其不良反應亦不容忽視［11-12］。CGN和抑郁癥目前均無明確病理機制及特效藥，而中醫在慢性疾病治療方面具有一定的優勢。中醫異病同治是中醫基礎重要理論之一，不同疾病其病機相同即可用同一藥方治療。參苓白術散出自《太平惠民和劑局方》［13］。已有研究［14］表明，加味參苓白術散治療脾腎兩虛型CGN，療效確切，改善臨床癥狀效果顯著；也有研究［15］表明，以參苓白術散為底方，運用健脾益氣法治療老年抑郁癥患者，總有效率91%。由于CGN和抑郁癥均有脾虛證，而參苓白術散有益氣補脾的作用，為異病同治提供了理論依據。

網絡藥理學主要通過建立“成分-靶標-通路-疾病”網絡的方法分析藥物的作用機制［16］，由此可知一種靶點可調控多種疾病，這種調控過程和中醫的異病同治類似。參苓白術散治療CGN和抑郁癥均效果良好，因此，本研究擬通過網絡藥理學及分子對接的方法分析其異病同治的作用機制，以證明中醫藥在2種疾病中的作用。

1 材料與方法

1.1 參苓白術散化學成分及靶點的搜尋

運用中藥系統藥理學（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）數據庫和分析平臺（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），搜索參苓白術散方組成中10種中藥的活性成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性指數（drug like index，DL）≥0.18［17］為條件，對收集的信息進行篩選。并利用 Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org）的注釋文件將藥物靶點基因規范化。

1.2 參苓白術散治療CGN和抑郁癥共同靶點的篩選

利用GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org）和OMIM數據庫（https：//www.omim.org），獲取CGN和抑郁癥的對應靶點。將該靶點及參苓白術散對應的靶點導入在線軟件Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）取交集，并繪制韋恩圖。

1.3 “中藥-活性成分-共同靶點”網絡的構建

用Cytoscape3.8.2軟件構建參苓白術散治療CGN和抑郁癥的“中藥-活性成分-共同靶點”網絡。對上述網絡進行拓撲分析，其中，度的數值越大，該成分越有可能為參苓白術散治療的潛在活性成分。

1.4 關鍵靶點的篩選

在STRING數據庫（http：//string-db.org）中上傳共有靶點，并將物種設置成人類，取最高置信度，數值0.900，其余參數設置為默認，獲得蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡。將結果導入Cytoscape軟件可視化，拓撲分析后選取度值較高的前10個靶點，即參苓白術散異病同治的核心靶點。

1.5 通路分析

將共同靶點導入DAVID 6.8數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/），限定物種為人類，對參苓白術散“異病同治”的作用靶點進行富集分析，按P值從小到大排序，繪制排名前20的結果圖。

1.6 分子對接

從TCMSP數據庫和RCSB蛋白質數據庫（https：//www.rcsb.org/）分別下載活性成分的分子結構，以及核心靶點對應蛋白的晶體結構，并導入Sybyl-X2.1.1軟件進行分子對接。若對接得分＞4.25，表明分子與蛋白具有對接活性；若對接得分＞5，表明具有較好的對接活性；若對接結果＞7，則認為具有高度的對接活性。

2 結果

2.1 參苓白術散的活性成分和靶點篩選

從TCMSP數據庫中獲得參苓白術散中10味中藥的活性成分，其中，人參22種、白術7種、茯苓15種、桔梗7種、白扁豆1種、甘草92種、蓮子心11種、薏苡仁9種、山藥16種、砂仁10種，將活性成分對應靶點刪除重復后獲得225個靶點，將結果繪制“成分-靶點”網絡圖（圖1）。

圖1 “成分-靶點”網絡圖Fig.1 "Component-target" network diagram

2.2 CGN和抑郁癥的靶點預測

在GeneCards數據庫和OMIM數據庫中，CGN對應刪除重復后靶點1 806個，抑郁癥對應刪除重復后靶點12 997個。在Venny2.1.0中得到參苓白術散異病同治2種疾病潛在作用靶點共計103個，并繪制韋恩圖（圖2）。

圖2 共有作用靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of common action target

2.3 “中藥-活性成分-共同靶點”網絡結構

在參苓白術散異病同治2種疾病的“中藥-活性成分-共同靶點”網絡圖（圖3）中，活性成分槲皮素（MOL000098）、木犀草素（MOL000006）、山奈酚（MOL000422）為參苓白術散異病同治的關鍵活性成分，其中，槲皮素作用于75個靶點，網絡度最好。

2.4 PPI網絡構建與關鍵靶點篩選

構建的PPI網絡圖共有節點97個，邊912個。其中，參苓白術散異病同治的核心靶點是STAT3、JUN、RELA、MAPK1、TP53、AKT1、HSP90AA1、MAPK14、IL6、ESR1。

2.5 通路分析

共獲得參苓白術散與疾病共有靶點的基因本體論（gene ontology，GO）富集結果508條（P＜0.05），共同靶點主要影響生物學結果（biological process，BP）383條，主要包括DNA模板轉錄的正調節、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、對藥物的反應；結果中，細胞的組成（cellular component，CC）43 條，主要包括胞外區、細胞質、細胞外間隙；分子功能（molecular function，MF）的結果82條，主要包括蛋白質結合、轉錄因子結合、酶結合等。

京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析涉及信號通路109條（P＜0.05），其中，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、Toll樣受體信號通路、缺氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號通路、以磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信號、核苷酸結合寡聚化結構域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）樣受體信號通路為參苓白術散異病同治的主要的“明星通路”。

2.6 分子對接

對接結果顯示，分子與晶體均具有結合活性。其中α-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT）1與3種蛋白晶體均具有較好的對接活性，與槲皮素對接得分7.617，具有高度的對接活性。依據對接得分值繪制熱圖（圖4），同時繪制AKT1與3種活性成分對接構象（圖5）。

圖4 對接得分值熱圖Fig.4 Docking scoring value heat map

圖5 AKT1與槲皮素、木犀草素、山奈酚對接構象Fig.5 Docking conformation of AKT1 with quercetin，luteolin and kaempferol

3 討論

中醫理論認為，CGN與抑郁癥的共同發病機制在于脾失健運。參苓白術散作為補益脾胃的經典方劑，已被臨床廣泛應用。異病同治是中醫辨證論治的基本特點之一，也是《黃帝內經》原文中“治病必求于本”的重要體現［18］。在古代醫書中雖未記載CGN病名，但根據其癥狀，可從醫家經典中發現一些線索。如《黃帝內經》中有“慢腎風”“風水”“水脹”等病名；《金匱要略》中也提到十一類水腫；這些疾病的臨床表現與CGN類似［19-21］。脾虛是CGN的核心病機，正所謂“四季脾旺不受邪”［22］。脾失固攝則精微物質下泄，尿中出現蛋白等物質［23］，脾虛則土不制水故出現水腫。海派名醫童少伯從脾論治CGN，認為CGN病本在脾，脾在中焦調控肺腎兩臟［24］。《黃帝內經》有云“脾在志為思”“思傷脾”，憂思過度則會傷及脾臟，脾的運化功能與西醫消化系統相似，現代研究［25-26］表明腸道菌群可影響神經遞質、HPA軸等，從而導致抑郁癥。

槲皮素是參苓白術散中對應靶點最多的核心成分。已有研究［27-28］表明，槲皮素有抗炎、抗氧化、預防神經凋亡等作用，戴恩來等［29］研究表明槲皮素干預可修復足細胞損傷，進而保護腎小球濾過膜。華深等［30］通過對小鼠進行應激刺激并用槲皮素進行干預，闡明了槲皮素對抑郁癥的治療效果及機制。

本研究中，KEGG分析結果發現，參苓白術散作用于109個信號通路，其中TNF信號通路等5種信號通路相關性較高。TNF信號通路作為一種炎癥信號通路，介導多種炎癥反應，調控多種炎性細胞因子的表達，TNF信號通路及其下游白細胞介素-6等炎性細胞因子在抑郁癥患者外周血中濃度增加［31］，在腎組織中TNF信號通路及下游表達升高則會導致細胞因子失衡，進而增加CGN的疾病進展的風險［32］。Toll樣受體可觸發產生免疫復合物，與腎臟損傷有一定的聯系［33］。研究［34］發現，慢性腎炎患者外周血淋巴細胞中，Toll樣受體表達顯著上調，引起炎癥損傷。通過調控Toll樣受體信號通路可修復神經損傷，達到抗抑郁的效果［35］。HIF-1和NOD樣受體信號通路參與多種炎癥反應，NOD樣受體信號通路可以激活下游核因子κB信號通路［36］，這些炎癥反應均參與CGN和抑郁癥發生和發展，調控上述2種信號通路在疾病抗炎治療中起重要的作用。PI3K-AKT信號通路參與多種自身免疫性疾病，在多種慢性腎臟病中顯著上調并參與炎癥和增殖，且該通路與抑郁癥的關系明確，多種抗抑郁藥物通過該通路發揮作用，如文拉法辛可通過該通路抑制神經元凋亡［37］，從而發揮抗抑郁的作用。

本研究通過2種技術對參苓白術散治療CGN及抑郁癥的作用機制進行了分析，與異病同治理論相對應。將參苓白術散治療2種疾病的共同靶點構建PPI網絡，發現10個核心靶點作用于RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、DNA模板轉錄的正調節、對藥物的反應等生物學過程，調節多種信號通路，繼而調控CGN與抑郁癥。分子對接結果顯示，上述10個核心靶點與參苓白術散的主要活性成分都具有對接活性，也從側面證明了參苓白術散主要是通過這些核心靶點對CGN及抑郁癥發揮異病同治的作用。值得注意的是，AKT1與這3種活性成分都具有最高的對接得分。AKT1也是PI3K-AKT信號通路的重要組成部分，該通路也是參苓白術散異病同治過程中的“明星通路”，也從一定程度上反映了參苓白術散可以通過這些核心靶點發揮異病同治的作用。

綜上所述，本研究在微觀上證明了異病同治理論的可行性，豐富了其內涵。雖然應用網絡藥理學和分子對接的方法可以探究中藥在CGN與抑郁癥的作用機制，但其本身具有一定的局限性，因此，仍然需要進一步研究驗證。