精子DNA碎片指數(shù)對體外受精不同助孕方式妊娠結(jié)局的影響

檀暢，王喜良，張金艷，魏威，鄒朋書，羅麗雙，于月新

（北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學科，沈陽 110003）

隨著輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展，男性不育日益引起人們的關(guān)注。評估男性生育力的傳統(tǒng)指標主要包括精液體積、精子濃度、活力、前向運動能力和精子形態(tài)等常規(guī)質(zhì)量參數(shù)。但有研究［1-2］顯示，精液常規(guī)化驗結(jié)果正常的男性中仍有15%不育。由此可見，常規(guī)精液分析對男性不育的臨床診斷和生育力評估存在局限。隨著精子研究的不斷深入，評價DNA損傷程度的精子DNA碎片指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI）逐漸成為評價男性精子質(zhì)量的一項新指標。DFI是指在精子生成和成熟過程中，由于精子DNA完整性被破壞而產(chǎn)生斷裂碎片的程度。研究［3］報道，DFI升高會降低體外受精（in vitro fertilization，IVF）周期的妊娠率，但對卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplamsic sperm injection，ICSI）周期沒有影響。有研究［4］持相反意見，認為DFI對精子受精能力和妊娠結(jié)局有重要影響，精子DNA一旦被破壞，IVF或ICSI周期的妊娠率都會下降。目前，DFI對IVF/ICSI新鮮移植周期妊娠結(jié)局的影響尚無定論。因此，本研究探討了DFI對不同助孕方式妊娠結(jié)局的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象和分組

收集2019年1月1日至2020年12月31日在我院生殖醫(yī)學科接受IVF/ICSI助孕并新鮮移植的683對不孕夫婦（683個周期）的臨床資料，其中IVF 367個周期，ICSI 316個周期。

納入標準：（1）女方年齡≤40歲；（2）女方抗米勒管激素≥1.1 ng/mL；（3）取卵日獲卵數(shù)≥5個；（4）均為新鮮移植周期。排除標準：男女雙方染色體異常；體格檢查有生殖道外傷史、器質(zhì)性病變；女方卵巢儲備功能低下，基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)＜5個；卵母細胞冷凍周期等。

將全部研究對象、IVF周期和ICSI周期分別根據(jù)DFI值分為3組：DFI≤15%組，精子DNA完整性較好；DFI＞15%～30%組，精子DNA完整性一般；DFI＞30%組，精子 DNA完整性較差。比較不同DFI組間精液參數(shù)及IVF/ICSI新鮮移植周期妊娠結(jié)局的差異。

比較IVF周期和ICSI周期患者的一般資料，包括男女雙方年齡和體質(zhì)量指數(shù)、女方獲卵數(shù)，均無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 精液分析：按照第5版世界衛(wèi)生組織《人類精液檢查與處理實驗室手冊》的操作標準，禁欲3～7 d后，手淫收集精液到無菌精液杯中，液化后吸取10 μL至Makler計數(shù)池，通過全自動精子分析儀操作系統(tǒng)CASA（美國Hamilton Thorne）進行精子濃度、前向運動精子百分率（progressive motility，PR）等常規(guī)檢測。Diff-Quik染色法評估至少200個沒有重疊的完整精子形態(tài)，人工對比單個異常形態(tài)精子，計算正常精子形態(tài)率（normal sperm morphology rate，NSMR）。

1.2.2 精子DFI檢測：采用流式細胞儀（美國BD Accri C6）檢測，按照精子核完整性染色試劑盒（浙江星博生物科技）說明書操作。經(jīng)吖啶橙染色后上流式細胞儀檢測熒光，DFI（%）=綠色熒光數(shù)/（綠色熒光數(shù)+紅色熒光數(shù)）×100。

1.2.3 體外受精與胚胎移植：當優(yōu)勢卵泡直徑≥18 mm 時，肌肉注射人絨毛膜促性腺激素，34～36 h后經(jīng)陰道B超穿刺取卵，取出的卵細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。取卵日當天男方手淫留取精液，密度梯度離心上游法處理精液，根據(jù)精子上游后情況確定助孕方案。對于嚴重少弱畸精、穿刺取精、凍精復蘇和有過IVF助孕失敗者行ICSI助孕，精液正常者行IVF助孕。

受精16～18 h后出現(xiàn)雙原核為正常受精，胚胎培養(yǎng)至第3天（D3），分裂為7～9個細胞、細胞大小均勻、形態(tài)規(guī)則且碎片率＜25%的胚胎為優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎。囊胚評分參照Gardner人類囊胚分級系統(tǒng)，內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)外胚層細胞評分均為A或B的囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚，其中一個評分為C的囊胚為非優(yōu)質(zhì)囊胚，兩者評分均為C的囊胚為不可利用囊胚。新鮮移植周期選取1～2個優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植。

1.2.4 觀察指標：胚胎移植后14 d檢測血β人絨毛膜促性腺激素是否為陽性，陽性者28 d行B超檢查，檢查到孕囊和心管搏動，確定為臨床妊娠。預產(chǎn)期前后隨訪胎兒出生相關(guān)情況。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 不同DFI組精液常規(guī)參數(shù)的比較

將683對不孕夫婦的男方按DFI值分為3組，3組比較，NMSR無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05）。DFI＞30%組禁欲天數(shù)均明顯高于DFI≤15%組、DFI＞15%～30%組（P＜0.05），即隨著禁欲天數(shù)的增加，DFI值增大；DFI＞30%組精子濃度、PR均明顯低于DFI≤15%組、DFI＞15%～30%組（P＜0.05），即DFI值越大，精子濃度和PR越小。見表1。

表1 不同DFI組精液常規(guī)參數(shù)的比較Tab.1 Comparison of semen routine parameters among the three DFI groups

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，DFI與精液檢查禁欲天數(shù)呈正相關(guān)（r=0.150，P＜0.01），與精子濃度、PR呈負相關(guān)（分別為r=-0.135，r=-0.299，均P＜0.01）。

2.2 不同DFI組妊娠結(jié)局比較

將683對不孕夫婦的女方按DFI值分組，DFI≤15%組、DFI＞15%～30%組臨床妊娠率和活產(chǎn)率均高于DFI＞30%組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。見表2。

表2 不同DFI組妊娠結(jié)局的比較Tab.2 Comparison of pregnancy outcomes among the three DFI groups

2.3 IVF周期和ICSI周期精液常規(guī)參數(shù)的比較

IVF周期中，DFI≤15%組受精當日精子濃度顯著高于DFI＞30%組（P＜0.05），隨著DFI升高，PR有降低趨勢，但無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05）。ICSI周期中，DFI≤15%組受精當日精子濃度顯著高于DFI＞15%～30%組、DFI＞30%組（P＜0.05），DFI≤15%組受精當日PR顯著高于DFI＞30%組（P＜0.05）。見表3。

表3 IVF周期和ICSI周期精液常規(guī)參數(shù)的比較Tab.3 Comparison of semen routine parameters during IVF and ICSI cycles

2.4 IVF周期和ICSI周期妊娠結(jié)局的比較

IVF周期中，3個DFI組比較，臨床妊娠率、活產(chǎn)率均無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05）；ICSI周期中，DFI＞30%組臨床妊娠率、活產(chǎn)率均低于DFI≤15%組（P=0.048）、DFI＞15%～30%組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。見表4。

表4 IVF周期和ICSI周期妊娠結(jié)局的比較Tab.4 Comparison of pregnancy outcomes during IVF and ICSI cycles

3 討論

精子DNA攜帶父系遺傳信息，其完整性對成功妊娠和遺傳物質(zhì)傳遞至關(guān)重要。精子形成是多因素共同參與的過程，受到男性自身狀態(tài)、外界環(huán)境等因素干擾時可能產(chǎn)生碎片，造成精子DNA永久損傷，直接影響精子的正常功能［5］。本研究顯示，精子DFI與禁欲天數(shù)呈正相關(guān)，而與精子濃度、PR呈負相關(guān)，即隨著禁欲天數(shù)的增加，精子DFI升高，精子濃度和PR下降。其原因可能是精子在附睪中儲存時間越長，精子細胞凋亡、氧化損傷越嚴重，從而破壞精子核染色質(zhì)的完整性，導致精子質(zhì)量下降［6］。這與已有的研究［7-9］結(jié)果一致。因此，臨床上可建議患者縮短禁欲天數(shù)，降低DFI，從而改善精液質(zhì)量。

之前的研究［10］顯示，高DFI會降低IVF/ICSI周期妊娠率。然而最近的研究［11］表明，精子DFI并不影響IVF或ICSI周期的妊娠率。本研究與SUN等［11］的研究結(jié)果相似，DFI≤15%組、DFI＞15%～30%組臨床妊娠率和活產(chǎn)率均高于DFI＞30%組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），這可能與高DFI患者樣本量相對不足有關(guān)，后續(xù)研究應進一步擴大樣本量。

IVF和ICSI周期中，隨著DFI升高，精子濃度和PR均下降。IVF周期中，不同DFI組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率無統(tǒng)計學差異。但在ICSI周期中，DFI≤15%組、DFI＞15%～30%組臨床妊娠率和活產(chǎn)率均顯著高于DFI＞30%組（P＜0.05）。即DFI＞30%時，妊娠率和活產(chǎn)率顯著下降。2種受精方式的差別在于精液的處理過程，IVF周期將精液在37 ℃培養(yǎng)箱中上游至少15 min，篩選出活力好的精子進行受精，其過程可能更接近自然受精，按照優(yōu)勝劣汰的原則自動篩除掉高DFI的精子，因此對妊娠率影響不大。研究［12］報道，精液處理方法不同可能會影響精子DFI，密度梯度離心優(yōu)化后的精子DFI會顯著下降。NIU等［13］的研究也證實，在使用密度梯度離心優(yōu)化處理后的精子進行IVF時，精子DFI與妊娠結(jié)局無關(guān)。這表明適當?shù)木宇A處理會去除高DFI對卵母細胞受精和臨床妊娠結(jié)局的不利影響，與本研究結(jié)果一致。而ICSI周期由于沒有優(yōu)化處理精子，所以DFI≥30%組的妊娠率和活產(chǎn)率明顯低于DFI＜30%組。

近年來，關(guān)于DFI能否預測輔助生殖助孕的臨床結(jié)局，一直存在較大爭議。本研究發(fā)現(xiàn)，DFI升高，精子質(zhì)量下降，在一定程度上反映DFI與常規(guī)精液分析指標密切相關(guān)，可作為常規(guī)精液分析的有效補充。但對于DFI能否預測輔助生殖助孕結(jié)局，本研究結(jié)果顯示，不同水平DFI與IVF/ICSI周期的妊娠率和活產(chǎn)率不完全相關(guān)，造成妊娠結(jié)局的差異可能是精子優(yōu)化處理過程，也可能是卵母細胞本身的修復能力，對輕微的DNA損傷自動啟動修復程序［14-15］。

綜上所述，對高DFI的患者，由于卵母細胞修復能力有限，無法修復嚴重的精子DNA損傷，不建議盲目選擇并不會改善臨床妊娠結(jié)局的ICSI 方式助孕，但可以嘗試在縮短禁欲天數(shù)、優(yōu)化精液處理過程的同時綜合考慮精液檢查結(jié)果和女方情況等，確定最終助孕方案。