電子鼻結合HS-SPME-GC-MS分析輻照對甲魚預制菜揮發性風味成分的影響

徐遠芳 張祺玲 黃高柳 周毅吉 郭 峰 李文革 楊常林 彭 玲，*

(1 湖南省核農學與航天育種研究所/湖南省農業生物輻照工程技術研究中心/生物輻照技術湖南省工程研究中心，湖南 長沙 410125；2 長沙市農產品質量監測中心，湖南 長沙 410006；3 湖南華甲生物科技有限公司，湖南 常德 415000)

甲魚(Pelodiscussinensis)，又稱鱉、王八、水魚等，是一種名貴的水產經濟動物，主產于我國湖南、湖北、安徽、江蘇等省份[1]。甲魚肉質鮮美、營養價值高，含有豐富的氨基酸和不飽和脂肪酸等，是一種傳統的營養滋補佳品[2-4]，具有抗氧化、抗疲勞[5]、抗腫瘤[6-7]等功效。由于甲魚加工產業薄弱，我國目前市場上90%甲魚以鮮活銷售為主。對于普通消費者而言，甲魚挑選難、宰殺難和烹飪難，是影響消費需求的重要原因[8]。預制菜因方便、快捷等優勢受到消費者青睞，已成為當前消費市場新的風口，以鮮活甲魚來加工方便快捷、營養美味甲魚預制菜的市場潛力很大。但甲魚預制菜因營養豐富、含水量高，在加工和貯藏過程中易受微生物污染而發生腐敗變質。食品輻照作為一種安全的食品“冷巴氏殺菌”技術，已得到眾多國家和國際食品組織及專業團體的認可和支持，應用前景廣闊[9]。近年來，關于水產品輻照保鮮的研究已有較多報道，多集中在水產品電子束輻照研究方面，表明利用合適劑量的輻照處理能有效延長水產品的保質期，并較好地保持其原有品質[10-13]。

在輻照過程中，食品中的水輻解后所產生的·OH、 H·等活性自由基會加速脂肪、蛋白質等成分的氧化和降解，生成低分子的醛、酮類等物質，有可能導致食品風味發生變化[14-15]。研究表明，水產品經高劑量輻照處理后容易出現異味，對其感官品質產生不良影響，已成為影響輻照技術在水產品加工中應用的主要因素[16-17]。因此，利用輻照技術對甲魚預制菜殺菌保鮮的同時，還應重點關注其風味的變化。目前，國內外關于輻照對甲魚預制菜風味影響的研究報道尚鮮見。本試驗采用不同劑量的60Co-γ射線輻照處理甲魚預制菜，通過感官評定并利用電子鼻結合頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)對其揮發性成分進行檢測，通過對電子鼻響應值的方差分析、載荷分析(loading analysis,LA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)和線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)，并結合相對氣味活度值(relative odor activity value，ROAV)評價各揮發性成分對甲魚預制菜總體風味的貢獻，探究輻照對甲魚預制菜揮發性風味成分的影響，以期為輻照技術在甲魚預制菜殺菌保鮮中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活甲魚，購自湖南華甲生物科技有限公司，為湖南漢壽外塘養殖的純種中華鱉，雄性，體重2.0±0.1 kg。鮮活甲魚經宰殺、去內臟、去膜、去爪、切塊、焯水、洗凈、分裝入罐、加入配料、密封，利用高壓釜(121℃，103 kPa)預處理15 min，冷卻后即得甲魚預制菜，每罐凈重500±25 g。

1.2 儀器與設備

PEN3電子鼻系統，德國Airsense公司；7890B-7000C-GC/MSD氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司；65 μm CAR/PDMS萃取頭，美國Supelco公司；FSH-2高速分散均質機，常州市金壇友聯儀器研究所；TX2202 L電子天平，日本SHIMADZ公司。

1.3 試驗方法

1.3.160Co-γ射線輻照 輻照在湖南省農業科學院核農學與航天育種研究所湖南輻照中心進行，放射源為60Co，放射性活度為3.14×1016Bq，單板源。采用動態步進方式輻照，輻照過程中自動換面，平均劑量率約為83.33 Gy·min-1。輻照過程使用經中國計量科學研究院國家劑量保證服務(NADS)比對標定的重鉻酸銀和重鉻酸鉀(銀)劑量計(偏差<5%)進行劑量跟蹤，各劑量組設3個平行。輻照劑量設定值為0、5、7.5、10 kGy，輻照劑量實測值為0、4.7、7.1、9.9 kGy。

1.3.2 感官評價 評定小組由10名經過食品感官評定培訓的人員組成，分別從氣味、滋味、色澤以及組織狀態四個方面對甲魚預制菜進行評分。評價前，讓品評員熟悉甲魚預制菜的感官特性，評價前后均用清水漱口，評價步驟為先聞其氣味，然后在自然光下觀察其色澤，再通過手觸摸、手捏及對其復熱后咀嚼來評價甲魚預制菜的組織狀態及滋味。甲魚預制菜的感官評價采用5分制，具體評定標準見表1，每項評分為去掉一個最高分和一個最低分的平均分。

表1 甲魚預制菜感官評定標準Table 1 Standards for sensory evaluation of pre-prepared soft-shelled turtle

1.3.3 HS-SPME-GC-MS檢測 取甲魚預制菜樣品，剔除背殼、骨頭等堅硬組織，剩余的甲魚肉質部分用均質機打碎，混勻。樣品揮發性成分的萃取方式與氣相色譜-質譜聯用儀(chromatography-mass spectrometry,GC-MS)檢測條件參考賈培培等[18]的方法，準確稱取甲魚肉2.00±0.01 g，置于20 mL頂空瓶中，加蓋密封，再插入65 μm CAR/PDMS萃取頭，于85℃水浴下吸附40 min，取出，進樣，于250℃下解吸5 min，啟動儀器采集數據，每個處理平行測定3次。

色譜條件：HP-5 MS色譜柱(30 m × 250 μm，0.25 μm)；載氣(He)流速1.2 mL·min-1；進樣口溫度250℃；初始溫度40℃，保持2 min，以5℃·min-1上升至90℃，再以8℃·min-1上升至170℃，最后以 10℃·min-1上升至250℃，保持5 min。

質譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；溫度250℃；掃描質量范圍m/z 33～450。

1.3.4 相對氣味活度值(ROAV)評價 利用ROAV法評價各揮發性成分對甲魚預制菜總體風味的貢獻大小，當ROAV≥1時，即判定該成分是甲魚預制菜的關鍵風味成分；當0.1≤ROAV<1時，即判定該成分對其總體風味具有重要修飾作用。確定對甲魚預制菜總體風味貢獻最大成分的ROAVmax=100，其他各成分的ROAV按式(1)計算[19]：

(1)

式中，Cmax、Tmax分別為對甲魚預制菜總體風味貢獻最大成分的相對含量及其感覺閾值，μg·kg-1；Ci、Ti分別為其他各揮發性成分的相對含量及其感覺閾值，μg·kg-1。

1.3.5 電子鼻檢測 準確稱取甲魚肉3.00±0.01 g于15 mL頂空瓶中，加蓋密封，于80℃下水浴30 min，取出后放至常溫。直接將電子鼻進樣針頭插入頂空瓶中，對其揮發性成分進行測定。該電子鼻包含由10個不同的金屬氧化物傳感器組成的傳感器陣列，各傳感器對應的特征揮發性成分見表2。

電子鼻條件：采樣時間1 s/組；清洗時間120 s；歸零時間10 s；樣品準備時間5 s；進樣流量400 mL·min-1； 分析采樣時間120 s。

表2 PEN3電子鼻傳感器性能描述[16]Table 2 Performance descriptions of PEN3 electronic nose sensors[16]

1.4 數據處理

對甲魚預制菜揮發性風味成分電子鼻測定結果，利用SPSS 20.0軟件中的Duncans模型對各傳感器的響應值進行方差分析，并利用電子鼻自帶的WinMuster軟件進行LA分析、PCA分析和LDA分析。對甲魚預制菜揮發性成分的GC-MS測定結果，通過計算機檢索與標準譜庫NIST11相匹配，僅報道相似度≥80的鑒定結果，按峰面積歸一化法計算各揮發性成分的相對百分含量，計算結果以3次平行測定的平均值計[16]。

2 結果與分析

2.1 輻照前后甲魚預制菜的感官評分結果

不同劑量輻照后甲魚預制菜的感官評分結果見圖1。結果表明，對照組(0 kGy)甲魚預制菜固有氣味和鮮味濃郁，無異味，外觀顏色正常，背面呈深灰色，腹面呈乳白色，光澤度好，肉質緊實，裙邊堅實且富有彈性。與對照組相比，4.7 kGy組的氣味、滋味、色澤和組織狀態變化不顯著(P>0.05)，表明4.7 kGy輻照處理不會對甲魚預制菜的感官品質產生顯著影響。隨著輻照劑量的增加，7.1和9.9 kGy組會產生輕微的異味，但仍具有甲魚肉的固有氣味和鮮味，其色澤和組織狀態均無顯著變化(P>0.05)。綜合感官評分結果認為，5 kGy以內劑量輻照對甲魚預制菜的感官品質影響不大，高于5 kGy時可能會影響其氣味和滋味，進而導致產生異味。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level.圖1 不同劑量輻照后甲魚預制菜的感官評分結果Fig.1 Sensory evaluation result of pre-prepared soft-shelled turtle irradiated with different doses

2.2 輻照前后甲魚預制菜的電子鼻響應值

電子鼻各傳感器對不同劑量輻照后甲魚預制菜揮發性風味成分的響應值見圖2。結果表明，對照組電子鼻傳感器S2、S6、S8、S9的響應值較高，其中S9的響應值最高，說明該傳感器對甲魚預制菜揮發性氣味的響應最強，其他各傳感器對甲魚預制菜氣味的響應較低，說明其對樣品氣味檢測的貢獻較小。與對照組相比，傳感器S2、S6、S8和S9對4.7、7.1、9.9 kGy組的響應值均發生顯著變化(P<0.05)，隨著輻照劑量增加呈先減小后增大的趨勢。

2.3 輻照前后甲魚預制菜電子鼻響應值的LA

不同劑量輻照后甲魚預制菜特征氣味響應值的LA結果見圖3。傳感器S9對PC1的貢獻率最大，其次是S2、S6。傳感器S6對PC2的貢獻率最大大，S8次之，且輻照前后樣品PC1、PC2的主要貢獻傳感器保持不變。因此，電子鼻對甲魚預制菜中芳香成分和有機硫化物、氮氧化合物、甲烷、醇類和醛酮類物質較為敏感，這些成分對風味的貢獻較明顯。

圖2 電子鼻傳感器對不同劑量輻照后甲魚預制菜的響應值雷達圖Fig.2 Radar chart of electronic nose sensor responses of pre-prepared soft-shelled turtle irradiated with different doses

2.4 輻照前后甲魚預制菜電子鼻響應值的PCA

由圖4可知，PC1的貢獻率為94.16%，PC2的貢獻率為5.25%，兩者累積貢獻率為99.41%，2個主成分能很好地反映樣品的整體信息。圖中各組樣品互不重疊，整體區分度較好，說明PCA方法適用于對不同劑量輻照后甲魚預制菜揮發物的分析。4.7 kGy組與對照組在PC1上未能完全分開，說明兩者風味整體差別較小。7.1和9.9 kGy組與對照組在PC1上距離相對較大，說明其風味存在一定差異。因此，輻照前后甲魚預制菜揮發物的差異與輻照劑量有關，且主要體現在PC1上。

圖3 不同劑量輻照后甲魚預制菜電子鼻響應值的LA圖Fig.3 LA of electronic nose response values of pre-prepared soft-shelled turtle irradiated with different doses

圖4 不同劑量輻照后甲魚預制菜電子鼻響應值的PCA圖Fig.4 PCA of electronic nose response values of pre-prepared soft-shelled turtle irradiated with different doses

2.5 輻照前后甲魚預制菜電子鼻響應值的LDA

由圖5可知，PC1的貢獻率為75.25%，PC2的貢獻率為15.30%，兩者累積貢獻率為90.55%。圖中各組樣品均無重疊，區分明顯，說明LDA能對不同劑量輻照后甲魚預制菜的揮發物進行有效區分。4.7 kGy組與對照組距離較近，7.1和9.9 kGy組與對照組距離相對較遠，說明7.1和9.9 kGy組與對照組的差異大于4.7 kGy組，表明高劑量輻照對甲魚預制菜的揮發物影響較大，這與PCA結果相符。

圖5 不同劑量輻照后甲魚預制菜電子鼻響應值的LDA圖Fig.5 LDA of electronic nose response values of pre-prepared soft-shelled turtle irradiated with different doses

2.6 輻照前后甲魚預制菜揮發性成分分析

不同劑量輻照后甲魚預制菜揮發性成分的組成不同，結果見表3。0、4.7、7.1、9.9 kGy組分別鑒定出56、66、66和61種揮發性成分。對照組揮發性成分以醛類為主，其次為烴類、醇類、含氮含硫及雜環類。與對照組相比，輻照后樣品醛類相對含量明顯降低，減少的主要成分是己醛、苯甲醛和辛醛，苯乙醛相對含量則增加；烴類、芳香族類相對含量增加，含量增加的烴類有十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、戊基環乙烷和姥鮫烷等；輻照后樣品均檢測出環十五烷、6,9-十七二烯、8-十七烯等新物質。輻照前后樣品中芳香族類差異明顯，輻照后產生多種新的苯和萘類化合物，酮類和酯類相對含量增加，并檢測出5-甲基-2-(1-甲基乙基)-2-環己烯-1-酮、乙酸丁酯以及甲酸(E)-9-十四烯-1-醇酯等新物質。隨著輻照劑量的增加，含氮含硫及雜環類相對含量先降低后增加，發生變化的主要成分為2-戊基呋喃和六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮；醇類相對含量整體變化不大，但輻照后1-辛烯-3-醇相對含量明顯降低，十四醇相對含量明顯增加。輻照后酸類相對含量降低，減少的主要成分是2-甲基戊酸酐，油酸和反油酸均未檢出，而棕櫚酸相對含量則增加。說明輻照處理對甲魚預制菜揮發性成分組成產生影響，進而可能導致其風味發生變化。

表3 不同劑量輻照后甲魚預制菜揮發性成分的相對含量Table 3 Relative content of volatile compounds in pre-prepared soft-shelled turtle irradiated with different doses /%

表3(續)

表3(續)

2.7 輻照前后甲魚預制菜揮發性成分的ROAV分析

揮發性成分對甲魚預制菜氣味的貢獻大小由含量和感覺閾值共同決定[23]。甲魚預制菜中壬醛的相對含量較高，且感覺閾值較低，對樣品總體風味的貢獻最大。以壬醛ROAV為100，計算其他各揮發性成分的ROAV，其中ROAV≥0.1的揮發性成分見表4。對照組甲魚預制菜中關鍵風味成分為壬醛、癸醛、辛醛、1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛和2-戊基呋喃。輻照后辛醛、己醛、1-辛烯-3-醇的ROAV降低，說明輻照處理降低了辛醛、己醛、1-辛烯-3-醇對樣品總體風味的貢獻率，其中1-辛烯-3-醇的ROAV隨輻照劑量增加而逐漸降低。隨著輻照劑量的增加，庚醛、2-戊基呋喃的ROAV先降低后增加。對照組中苯甲醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛對甲魚預制菜風味具有重要修飾作用，輻照后苯乙醛的ROAV增加，成為關鍵風味成分。

表4 不同劑量輻照后甲魚預制菜中揮發性風味成分的ROAVTable 4 ROAV of volatile flavor compounds in pre-prepared soft-shelled

3 討論

輻照在殺菌的同時會對肉品的風味產生重要影響，可能使其產生令人不愉快的異味[24]。利用電子鼻技術檢測肉品的特征氣味，可對不同劑量輻照處理肉品氣味輪廓進行快速區分[25-26]。本研究中，甲魚預制菜感官評價結果表明，4.7 kGy組與對照組相比無明顯差異，7.1和9.9 kGy組會產生異味，說明高于5 kGy劑量輻照處理會對甲魚預制菜的氣味和滋味產生明顯影響。甲魚預制菜輻照前后電子鼻特征氣味的響應值發生明顯變化，但發生變化的主要揮發性風味成分類別均為芳香成分和有機硫化物、氮氧化合物、甲烷、醇類和醛酮類化合物。利用PCA和LDA可對不同劑量輻照處理的甲魚預制菜進行有效區分，4.7 kGy組與對照組的氣味特征接近，而7.1、9.9 kGy組與對照組差異相對較大，說明7.1、9.9 kGy輻照后甲魚預制菜的氣味特征發生了明顯變化，這與感官評價試驗結果一致。因此，5 kGy以內劑量輻照處理對甲魚預制菜揮發性風味的影響不大，高于5 kGy劑量輻照可能對其揮發性風味成分產生影響并產生異味，這與前人研究輻照保鮮對水產品揮發性風味成分的影響所得出的結論相似。如楊文鴿等[15]研究表明低于5 kGy輻照后能較好地保持美國紅魚肉的原有風味，7、9 kGy時異味明顯；梅卡琳等[16]研究也表明經5 kGy及以下劑量輻照后蟹肉能較好地保持其原有嗅感，7和9 kGy輻照會導致輕微異味產生；瞿桂香等[17]、陳東清等[27]分別證實7和8 kGy及以上劑量輻照會使小龍蝦產生明顯的輻照異味。目前，關于肉品輻照后異味的形成機理已有較多報道，研究表明肉品的輻照異味主要來源于脂質氧化分解[28]和含硫氨基酸分解[29]所產生的異味成分。脂質的氧化與脂肪酸的不飽和程度密切相關，不飽和脂肪酸經輻照后所生成的自由基和氫過氧化物易攻擊氨基酸側鏈，產生揮發性羰基類化合物[30]。甲魚中不飽和脂肪酸和氨基酸含量高，使其在輻照殺菌過程中更容易發生氧化并進而產生異味，導致輻照后甲魚預制菜的揮發性風味發生變化。

HS-SPME-GC-MS分析結果表明，不同劑量輻照后甲魚預制菜揮發性成分的種類增多。醛類相對含量最高，壬醛、癸醛、辛醛、己醛、庚醛是其關鍵風味成分。醛類感覺閾值較低，對其風味起主要貢獻。輻照會誘發脂類氧化，生成低分子醛、酮類等物質，這類物質很可能是產生“輻照味”的主要因素[20]。輻照后醛類總相對含量降低，降低的醛類主要有己醛、苯甲醛、辛醛，而苯乙醛則增加，庚醛先降低后增加。酮類相對含量較低，輻照后酮類相對含量增加，新檢測出6-甲基-2-(1-甲基乙基)-2-環己烯-1-酮。輻照后烴類相對含量明顯增加，新產生環十五烷、6,9-十七二烯和8-十七烯。烷烴類閾值較高，對風味直接貢獻較小，而烯烴類可作為前體物質形成醛、酮類等[31]。醇類閾值一般較高，對整體氣味的貢獻較小[32]。醇類中1-辛烯-3-醇相對含量最高，且閾值較低，是甲魚預制菜的關鍵風味成分，被認為與新鮮魚的香氣有關[20,31]。本研究發現，隨著輻照劑量增加，1-辛烯-3-醇相對含量逐漸降低，這與楊文鴿等[21]的研究結果相似，被認為與高劑量輻照后梅魚魚糜凝膠香味變淡、略有異味有關。一些含苯環物質具有不良氣味，如甲苯、萘等，不同劑量輻照后芳香族類相對含量增加，其中，7.1、9.9 kGy組檢測出甲苯等物質，可能是輻照后甲魚預制菜產生異味的主要原因之一[16]。含氮含硫及雜環類物質閾值較低，是重要的風味物質。輻照后含氮含硫及雜環類物質先降低后增加，主要變化的成分是2-戊基呋喃和六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。普遍認為2-戊基呋喃是亞油酸的一種氧化產物，具有肉焦香味以及泥土、青草和類似蔬菜的香氣，其閾值較低，對肉品風味貢獻較大[33-34]。7.1、9.9 kGy組中2-戊基呋喃相對含量增加，表明高劑量輻照會促進脂質的氧化。此外，六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮相對含量也明顯增加，但其氣味特征及對風味的影響尚不明確。輻照后酸類總相對含量降低，減少的主要成分是2-甲基戊酸酐，油酸和反油酸均未檢出，而棕櫚酸相對含量則增加。酸類閾值較高且揮發性較低，對形成肉香味具有不可忽視的基底作用[35]。輻照后酯類相對含量增加，新產生乙酸丁酯和甲酸(E)-9-十四烯-1-醇酯。酯類能增強其他風味化合物的氣味，起著濃郁而柔和的基底作用[16]。

4 結論

經4.7 kGy輻照后，甲魚預制菜的整體風味無明顯變化，但7.1、9.9 kGy輻照會對其風味產生明顯影響，進而產生異味。利用電子鼻檢測結合PCA、LDA可有效區分不同劑量輻照處理的甲魚預制菜，4.7 kGy組與對照組氣味特征接近，7.1、9.9 kGy組與對照組差異相對較大。甲魚預制菜輻照前后特征氣味的差異主要表現在芳香成分和有機硫化物、氮氧化合物、乙醇、醇類和醛酮類物質。不同劑量輻照后甲魚預制菜揮發性成分的種類增多，關鍵風味成分為壬醛、癸醛、辛醛、己醛、庚醛1-辛烯-3-醇和2-戊基呋喃，苯甲醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛對其風味具有重要修飾作用。輻照后辛醛、己醛、1-辛烯-3-醇對風味的貢獻率降低，庚醛、2-戊基呋喃的貢獻率先降低后增加，苯乙醛的貢獻率增加并成為關鍵風味成分。因此，利用60Co-γ射線輻照對甲魚預制菜進行殺菌，劑量低于5 kGy時不會對其揮發性風味產生明顯影響。