樣本預處理方式對羅氏沼蝦碳和氮穩定同位素比值檢測的影響

李 月 劉 晃 謝正麗

(中國水產科學研究院漁業機械儀器研究所，上海 200092)

近些年，測定生物組織中自然產生的穩定同位素成為了生態學研究的重要工具，涉及的穩定同位素有碳穩定同位素、氮穩定同位素等[1]。其中碳穩定同位素比值(δ13C)常被用作確定食物網中消費者的食物來源，而氮穩定同位素比值(δ15N)則被用作確定食物網的結構和營養級[2]。

通過檢測水產品中的δ13C、δ15N，可為水產品的生長性能[3]、攝食食性[4-6]、產地溯源[7-9]等研究提供數據參考。羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)俗稱大頭蝦，是一種大型淡水蝦,因其高蛋白、低脂肪、富含人體必需的礦質元素和不飽和脂肪酸特點而深受國民喜愛，在我國的養殖產量已連續多年居世界第一[10]。準確檢測羅氏沼蝦的δ13C、δ15N，有利于開展羅氏沼蝦的食性、溯源等相關研究。由于穩定同位素比值檢測的樣本微量要求，新鮮采集的羅氏沼蝦不能立即選取肌肉組織進行檢測，有時需要冷藏、冷凍甚至短暫的常溫整蝦保存，直到有條件才進行制樣分析。而目前有關水產品δ13C、δ15N檢測的樣本預處理方式尚無統一標準，各研究者采用的預處理方式差異較大，不同預處理方式對水產品碳、氮穩定同位素比值造成的影響可能不同[11-14]。

冷凍保存對樣本穩定同位素比值的影響說法不一。有研究表明，冷凍保存對δ13C、δ15N沒有影響[11，15-17]，因為冷凍保存不涉及引入傳統化學法保存中的福爾馬林、甲醇等有機試劑[12，18-19]；也有研究發現冷凍保存對δ13C、δ15N有影響，甚至有些是明顯的影響[13，20-21]。此外，冷凍保存不適合野外采樣，大多水產品野外采樣受環境條件所限，在短時間之內較難實現快速冷凍保存，通常只能暫時常溫或冷藏保存樣本。水產品穩定同位素檢測的取樣方式有肌肉取樣、整體取樣，目前已有水母[21]、浮游動物、糠蝦[20]、文蛤[19]等進行整體取樣的報道，也有頭足類[21]、鱈魚[14]、虹鱒[19]等進行肌肉取樣的報道。整體取樣操作方便快捷，而肌肉取樣能消除腸道等其他生物物質對樣本的影響[22-23]，但肌肉取樣過程中可能使樣本受到外界環境污染，影響穩定同位素比值檢測。目前，對于整體取樣和肌肉取樣的樣本是否存在差異的研究甚少[24]。

因此，本研究探討了3種保存溫度(常溫23℃/15 d、冷藏2℃/90 d、冷凍-18℃/360 d)、2種取樣方式(蝦仁取樣、整蝦取樣)對羅氏沼蝦穩定同位素比值檢測的影響，討論不同預處理方式所引起的羅氏沼蝦δ13C、δ15N、C/N差異，以期為水產品碳和氮穩定同位素檢測的樣本預處理方式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

第一批活體沼蝦(單只約15 g，個頭大小基本一致)于2018年5月購自上海市虹口區曲陽菜市場，數量50只，用于不同保存溫度試驗。第二批活體沼蝦(單只約15 g，個頭大小基本一致)于2019年8月購自上海市虹口區曲陽菜市場，數量100只，用于不同取樣方式試驗。

δ13C的國際穩定同位素比值參考標準物質為Ⅴ-PDB，δ15N的參考標準物質為AIR(空氣)，此外，標準品選用德國IVA公司的尿素(δ13C = -41.30‰，δ15N = -0.32‰)，用于樣本穩定同位素比值的校正分析。

1.2 儀器與設備

Delta V Advantage穩定同位素質譜儀，美國ThermoFisher公司；BPG-9920AG鼓風干燥箱，上?；厶﹥x器制造有限公司；Classic DI超純水儀，英國ELGA公司；XS分析天平，美國METTLER TOLEDO公司；KG33NV冰箱，德國SIEMENS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本前處理方法 第一批沼蝦購買后于10 min內進行初步處理。隨機選取單只沼蝦，去除蝦殼后用超純水洗滌取蝦肌肉(蝦仁)組織，每個樣本放置于干凈的玻璃培養皿中，用一次性塑封袋密封，避免受到外界環境污染。樣本分為4組，第1組作為對照組，取蝦仁樣本直接干燥后檢測δ13C、δ15N、C/N。第2組取15只蝦仁樣本在23℃±1℃(室溫)條件下保存15 d。第3組取16只蝦仁樣本在2℃±1℃(冷藏)冰箱冷藏層保存90 d。第4組取12只蝦仁樣本在-18℃±1℃(冷凍)冰箱冷凍層保存360 d。

第二批沼蝦購買后于10 min內進行初步處理。隨機選取單只沼蝦，一部分去除蝦殼后用超純水洗滌取蝦仁組織；一部分取整蝦，樣本放置于干凈的玻璃培養皿中，用一次性塑封袋密封，避免受到外界環境污染。2種取樣方式的樣本保存溫度與第一批相同，保存時間為15 d。

取樣間隔周期：保存15 d以內的樣本取樣間隔周期為1 d，保存90 d以內的樣本取樣間隔周期為5 d，保存360 d以內的樣本取樣間隔周期為30 d。(注：隨機選取2019年冷凍9 d時的整蝦樣本10只，檢測得到樣本間的δ15N標準偏差為0.08，δ13C標準偏差為0.10,C/N標準偏差為0.03，3個參數的標準偏差在可允許的儀器誤差范圍之內，說明隨機選取單只沼蝦作為獨立樣本具有可行性，單個樣本之間的差異可以忽略，樣本數據的顯著差異主要由不同預處理方式引起。)

1.3.2 δ13C值和δ15N值檢測 選取沼蝦肌肉組織進行δ13C、δ15N和碳氮元素的質量百分含量檢測[13，25-26]。將冷藏和冷凍保存的樣本從冰箱取出后放至室溫，然后放入60℃烘箱中干燥至恒重；將常溫保存的樣本直接放入60℃烘箱中干燥。使用干凈的玻璃研缽將干燥后的蝦肉樣本研磨成粉末狀。稱取0.2 mg蝦肉樣本放置錫杯中壓扁。通過元素分析儀(Flash 2000系列)與Delta V Advantage穩定同位素質譜儀進行碳和氮穩定同位素比值檢測，穩定同位素儀器多次運行得到的δ13C和δ15N的分析精度均<0.1‰。為確保結果的準確性和重復性，每個樣本進行3次重復檢測，每檢測11個樣本后，分別穿插標準品檢測。δ13C、δ15N、C/N和3個參數的偏移量分別按下式計算：

δ13C=1 000×(Rm13-Rr13)/ Rr13

(1)

δ15N=1 000×(Rm15-Rr15)/ Rr15

(2)

C/N=m(C)/m(N)

(3)

ΔX =X(處理組)-X(對照組)

(4)

式(1)、式(2)中，δ13C和δ15N為實際樣本與參考標準樣本同位素比值的千分差，Rm13為實際樣本的13C同位素比值，Rr13為參考標準樣本的13C同位素比值；Rm15為實際樣本的15N同位素比值，Rr15為參照標準品的15N同位素比值。式(3)中，m(C)為碳元素的質量百分含量，m(N)為氮元素的質量百分含量。式(4)中，Δ為偏移量，X為δ13C或δ15N或C/N。

1.4 數據統計分析

使用方差分析統計不同保存溫度條件下，樣本與對照組之間的δ13C、δ15N、C/N差異，顯著性水平P設置為0.05。使用配對的t檢驗評估蝦仁取樣和整蝦取樣的偏移量是否顯著，顯著性水平P設置為0.01。所有統計分析均使用SPSS 16.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 不同保存溫度對樣本碳和氮穩定同位素比值的影響

在室溫條件下保存，第1天沼蝦有輕微異味產生，較粘稠，體表顏色由自然、透明而變深；第2天蝦肉局部腐爛，有較強的氨氣等異味；第3天肉質發黃，異味感強烈；第15天時，樣本袋中蝦仁樣本消失，袋內出現寄生蟲等生物。δ15N與對照組相比均顯著增加，第1～第15 天偏移量為1.31‰～13.16‰，偏移量平均值為6.02‰(表1)，其增幅和增速明顯高于冷藏、冷凍保存的δ15N(圖1)。而δ13C增幅相比δ15N明顯放緩(圖2)，第3～第6天、第8天、第12～第15天的 δ13C 與對照組相比差異顯著，偏移量為 0.19‰～0.56‰，偏移量平均值為0.33‰(表1)。C/N隨著保存時間的延長呈持續增加的趨勢(圖3)，第2～第15天的C/N偏移量為0.19～0.70，偏移量平均值為0.38(表1)。

在冷藏條件下保存，第1～第11天蝦肉呈半透明，有光澤，彈性尚好。此后肉質發黃，有較重的氨味，第15天時蝦肉局部發生腐爛，肉質發紅變黃。δ15N在第1～第35天接近于對照值，其變化幅度低于常溫、冷凍保存的δ15N(圖1)。第30～第55天、第65～第90天，δ15N顯著增加，偏移量為0.31‰～3.16‰，偏移量平均值為1.07‰(表1)。δ13C 在第5～第90天內發生明顯偏移，偏移幅度與常溫保存條件下的δ13C接近(圖2)，第5～第55天、第65天、第90天的偏移量為-0.35‰～0.70‰，偏移量平均值為0.25‰(表1)。C/N 與對照組相比降低(圖3)，第5～第30天、第65～第90天的偏移量為-0.55～-0.06，偏移量平均值為-0.24(表1)，變化趨勢與常溫的C/N相反。

在冷凍條件下保存，第30～第365天內解凍后的蝦體半透明、有光澤，彈性尚好，無異味產生。δ15N在第60～第240天明顯降低，偏移量為-1.40‰～-0.31‰，偏移量平均值為-0.79‰，變化趨勢與常溫、冷藏保存的δ15N相反，而在第270～第360天δ15N增加，偏移量為1.04‰～1.39‰，偏移量平均值為1.15‰(表1)。δ13C在第90 ～第240天小幅度增加，偏移量為0.07‰～-0.41‰，偏移量平均值為0.22‰，而在第270～第360天增加明顯，遠高于常溫和冷藏保存條件的δ13C(圖2)，偏移量為 2.34‰～2.84‰，偏移量平均值為2.57‰(表1)。C/N整體降低明顯(圖3)，第90～第180天，第240～第360天，偏移量為-1.34～-0.67， 偏移量平均值為-1.14(表1)?？梢姡诘?80 ～第240天，冷凍條件下的δ15N、δ13C、C/N各參數值均有發生轉折變化。

圖1 3種保存溫度對羅氏沼蝦δ15N的影響Fig.1 Effect of three preservation temperature on δ15N values of Macrobrachium rosenbergii

圖2 3種保存溫度對羅氏沼蝦δ13C的影響Fig.2 Effect of three preservation temperature on δ13C values of Macrobrachium rosenbergii

圖3 3種保存溫度對羅氏沼蝦C/N的影響Fig.3 Effect of three preservation temperature on C/N values of Macrobrachium rosenbergii

表1 3種保存溫度樣本δ13C、δ15N、C/N與對照組的差異Table 1 Differences of δ13C、δ15N、C/N between three preservation temperatures treated samples and control sample

2.2 不同取樣方式對樣本碳和氮穩定同位素比值的影響

蝦仁取樣和整蝦取樣對樣本δ15N、δ13C影響明顯，影響的方向(增加或減少)與保存溫度條件有關。2種取樣方式在常溫保存下δ15N、δ13C、C/N的偏移方向一致：δ15N偏移均增加(圖4-A)、δ13C偏移均減少(圖5-A)、C/N偏移均增加(圖6-A)；而2種取樣方式在冷藏、冷凍保存下δ15N、δ13C、C/N的偏移有增加也有減少(圖4～圖6)。

2種取樣方式在冷凍和常溫保存下的δ15N偏移方向整體相反。在冷凍保存第2～第13天，整蝦取樣的△δ15N 整體明顯高于蝦仁取樣的△δ15N(表2)，整蝦取樣的△δ15N為-1.00‰～1.99‰，蝦仁取樣的△δ15N為 -2.44‰～0.83‰(圖4-C)。而在常溫保存第3～第15天，整蝦取樣的δ15N偏移量顯著低于蝦仁取樣的δ15N偏移量(表2)，整蝦取樣的△δ15N為 0.30‰～ 5.70‰，蝦仁取樣的△δ15N為-0.71‰～7.84‰(圖4-A)。

整蝦取樣在冷凍保存下的δ13C偏移量整體顯著高于蝦仁取樣的δ13C偏移量(表2)，在冷凍保存第2～第13天，整蝦取樣的△δ13C為-0.57‰～0.40‰，蝦仁取樣的△δ13C為-1.19‰～0.65‰(圖5-C)。整蝦取樣在常溫保存下的C/N偏移量也整體顯著高于蝦仁取樣的C/N偏移量(圖6-A)，在常溫保存第1～第15天，整蝦取樣的△C/N為0.17～1.53，蝦仁取樣的△C/N為0.16～0.89(圖6-A)。2種取樣方式在冷藏、冷凍保存下的C/N 偏移量大多無顯著差異(表2)。

綜上可知，由于羅氏沼蝦含水量多、蛋白質含量較高[25-26]，3種保存溫度條件均容易引起樣本碳和氮穩定同位素比值的顯著變化，2種取樣方式下樣本δ13C、δ15N的偏移量也有顯著差異，增加或減少還與保存溫度條件有關，影響了樣本檢測數據的真實性。在常溫保存第1～第15天內樣本同位素比值整體明顯增加，δ15N變化尤為顯著，其偏移量遠高于冷藏90 d、冷凍保存360 d的δ15N偏移量；冷藏保存第5～第90天樣本δ15N整體增加，δ13C變化明顯，C/N整體明顯減少；冷凍保存羅氏沼蝦不宜超過60 d，在第60～第360天樣本的δ13N、δ15N、C/N均整體發生變化，在第240～第360天變化尤為顯著。

3 討論

在野外采集羅氏沼蝦后不能及時進行新鮮樣本的穩定同位素比值檢測時，常會將樣本進行保存預處理。目前有關樣本保存溫度、樣本取樣方式預處理對δ13C、

表2 3種保存溫度下2種取樣方式的△δ15N、△δ13C、△C/N T檢驗分析結果差異Table 2 Results between the two sampling treated samples (△δ15N、△δ13C、△C/N) at three preservation temperatures of t-test

注：A:常溫保存； B:冷藏保存； C:冷凍保存。下同。Note: A: Room temperature preservation. B: Refrigerated preservation. C: Frozen preservation. The same as following.圖4 2種取樣方式與對照組羅氏沼蝦δ15N偏差的變化Fig.4 Changes in δ15N values of Macrobrachium rosenbergii under the two different sampling treatments relative to the control samples

圖5 兩種取樣方式與對照組羅氏沼蝦δ13C偏差的變化Fig.5 Changes in δ13C values of Macrobrachium rosenbergii under the two different sampling treatments relative to the control samples

圖6 兩種取樣方式與對照組羅氏沼蝦C/N偏差的變化Fig.6 Changes in C/N values of Macrobrachium rosenbergii under the two different sampling treatments relative to the control samples

δ15N影響的說法不一，不同預處理方式下的樣本檢測結果準確度無法保障。因此，本研究選取3種保存溫度(常溫23℃/15 d、冷藏2℃/90 d、冷凍-18℃/360 d)、2種取樣方式(蝦仁取樣、整蝦取樣)，以新鮮沼蝦樣本作為對照組，研究不同保存溫度和取樣方式對羅氏沼蝦δ13C、δ15N、C/N的影響。結果表明，3種保存溫度、2種取樣方式對羅氏沼蝦碳和氮穩定同位素比值具有明顯影響，這與Syvaranta等[13]、Wolf 等[20]、Fleming等[21]的研究結果相似。

本試驗中，常溫保存樣本的δ15N、C/N在第1天顯著增加(表1)，結合其外部形態變化，原因是細菌分解引起樣本氮元素質量和較輕的氮同位素減少。常溫保存條件接近蝦體附帶的嗜冷菌的最適溫度[27]，加之蝦肉水分和蛋白質含量高(水分含量77%～78%，粗蛋白含量17%～20%)[27-28]，蝦肉在常溫條件下極易被附帶的細菌分解。李燕等[29]發現羅氏沼蝦于10℃條件保存時，第2天細菌達到3.3×107CFU·g-1(平均需氧平板計數)，超過可接受的107CFU·g-1極限值。Shamshad等[30]測定墨吉對蝦在0～35℃條件保存24 h后，平均需氧平板計數由5.0×105CFU·g-1增至6.4×109CFU·g-1。細菌在繁殖過程中產生各種酶類和毒性物質，這些物質促使蝦肉組織分解代謝為較簡單的氨、胺類等揮發性含氮物質[31]。隨著保存時間延長，含氮化合物等揮發性成分不斷形成并揮發損失，當氮元素的損失量高于碳元素的損失量時，C/N明顯升高。此外，由于微生物在分解過程中的運動同位素效應和同位素分餾作用[32]，在常溫下保存，沼蝦肌肉δ15N隨時間延長而顯著增加。

冷藏保存顯著影響羅氏沼蝦的δ13C、δ15N。樣本冷藏保存第11天時肉質開始腐爛，δ13C從第5天起發生顯著變化，δ15N從第40天時顯著增加(表1)。隨著冷藏保存時間的延長，沼蝦肌肉組織也會逐漸被微生物分解，從而導致δ13C、δ15N持續增加，有研究表明在5℃條件冷藏保存15 d內，從蝦的提取物中發現了三甲胺/氨氣等可揮發氮物質[33]，冷藏條件下C/N降低，說明碳元素的損失量大于氮元素的損失量。樣本在不同溫度下的優勢菌種不同，可能是常溫和冷藏保存條件下 δ13C、δ15N的變化時段不同的原因。

冷凍保存在60 d內對羅氏沼蝦的δ13C、δ15N無顯著影響，長時間冷凍保存變化明顯。冷凍常被作為一種理想的樣本保存方式，普遍認為其不影響樣本穩定同位素比值[11，15,17]，更有研究報道冷凍條件下的有效保存時間可達24個月之久[34]。雖然本試驗在冷凍保存360 d內蝦體解凍后的外觀良好，然而冷凍60 d后沼蝦δ13C、δ15N、C/N均發生明顯變化(圖1～圖3)，這與一些研究報道冷凍顯著影響浮游動物的δ15N[21]、文蛤的δ13C、δ15N[13]、糠蝦的δ13C、δ15N[20]的結果相似，如δ13C文蛤在-20℃冷凍保存7 d后δ13C和δ15N與新鮮樣本組相比變化顯著[18]；糠蝦在-10℃冷凍保存7 d后δ13C、δ15N與對照組相比變化顯著，δ13C差異為0.76‰±0.41‰,δ15N差異為0.37‰±0.16‰[20]；水母在-20℃冷凍保存6個月后δ13C差異為2‰[21]。

冷凍保存后的樣本δ13C、δ15N和C/N顯著降低，可能是由樣本在解凍過程中，冰晶形態分布發生改變，肌肉組織細胞破裂使細胞液流出，并發生脂肪氧化和蛋白質氧化變性共同導致[35-37]。Salonen等[35]研究發現牡蠣在冷凍保存期間碳元素質量顯著減少，Feuchtmayr等[36]對比正常冷凍樣本 (-20℃) 與液氮沖擊冷凍樣本對浮游動物δ13C和δ15N的影響，發現δ13C、δ15N減少與細胞物質的浸出有關。Dannheim等[24]推測海底大型底棲動物樣本在整體冷凍保存后發生細胞機械破壞溶解，導致樣本碳氮損失。

本試驗中的2種取樣方式顯著影響樣本δ13C、δ15N。不同形態的樣本在不同溫度條件下受到機械破壞的程度不同。在冷凍條件下，與蝦仁樣本相比，整蝦樣本的體積和質量更大，需要更長的平衡時間。較慢的冷凍會在樣本組織內形成較多的冰晶，而冰晶會機械破壞樣本組織細胞，最終導致細胞液泄漏發生物質損失[35-36]。在凍結過程中，液體體積膨脹與樣本質量的拮抗力引起的機械應力可能也會進一步損傷組織細胞。在冷凍和解凍的過程中，組織細胞受到破壞，細胞物質流出和脂肪酸、蛋白質氧化等因素綜合引起了整蝦和蝦仁取樣后樣本δ15N、δ13C的不同。在常溫條件下，蝦仁取樣的δ15N整體顯著高于整蝦取樣，可能是由于蝦仁相比整蝦沒有蝦殼保護、完全暴露于空氣中，常溫下與微生物接觸發生分解的速度更快，而微生物等生命體在合成脂肪的過程中，會發生明顯的碳歧視效應，即趨向于利用較輕的12C合成脂肪[38-40]，導致2種取樣方式的δ13C偏移量不同。今后研究需要進一步結合樣本組織細胞物質流出、微觀結構觀察，以篩選更加可靠的碳和氮穩定同位素檢測的樣本保存及取樣方式預處理方法。

4 結論

本研究結果表明，常溫(23℃)和冷藏(2℃)保存不適合羅氏沼蝦穩定同位素比值檢測、冷凍(-18℃)保存羅氏沼蝦不宜超過60 d；整蝦取樣和蝦仁取樣對樣本δ15N、δ13C也有顯著影響，偏移量的增加或減少與保存溫度有關。因此，在檢測水產品碳、氮穩定同位素比值時，需慎重考慮不同保存溫度和取樣方式對檢測結果的影響。建議新鮮沼蝦采集后立即干燥并開展碳和氮穩定同位素比值檢測。