二苯-α-吡喃酮類鏈格孢霉毒素和人血清白蛋白的相互作用及機理探究

任思瑞 李道亮 周鴻媛 郭 婷 張宇昊,2 馬 良,2,*

(1 西南大學食品科學學院，重慶 400715；2 西南大學生物學研究中心，重慶 400715)

鏈格孢霉菌屬極易污染小麥、大麥、燕麥、高粱等農作物和番茄、柑橘、蘋果等果蔬及其制品[1-4]，其次級代謝產物主要有二苯-α-吡喃酮類鏈格孢霉毒素[鏈格孢酚單甲醚(alternariol monomethyl ether，AME)、鏈格孢酚(alternariol，AOH)和交鏈孢烯(altenuene，ALT)等]、四酸類鏈格孢霉毒素[細交鏈格孢菌酮酸(tenuazonic acid，TeA)和異-細交鏈格孢菌酮酸(iso-tenuazonic acid，iso-TeA)]等[5-6]。其中AME和AOH由于污染范圍廣、毒性較大而受到較高關注[7-9]。研究表明，AME和AOH對動物體具有潛在致癌性、發育與遺傳毒性作用，且二者之間具有協同效應[10]。但目前鏈格孢霉毒素毒性資料較為缺乏，絕大多數國家和地區針對此類毒素仍沒有限量標準。2019年歐盟發布了一份監測食品中鏈格孢霉毒素(AME、AOH、TeA)的建議草案，建議AME和AOH在加工番茄制品、芝麻、葵花籽、葵花籽油以及嬰幼兒谷類食品的基準值為5～30 μg·kg-1[11-14]，這對補充和完善相關的毒理學資料具有重要意義。人血清白蛋白(human serum albumins，HSA)是外源性小分子進入血液中的常見轉運工具[15-17]。本研究體外模擬生理血液pH條件，通過穩態熒光光譜、同步熒光光譜、3D熒光光譜和圓二色光譜方法，探究二苯-α-吡喃酮類鏈格孢霉毒素(AME、AOH)與HSA的相互作用，并對其相互作用過程中的猝滅速率常數、結合常數、結合位點數、結合距離、結合作用力等信息進行分析，初步探討鏈格孢霉毒素結構性質及其與人血清白蛋白相互作用后對蛋白結構變化的影響，這對補充和完善該類毒素的毒理學資料及其安全風險評估具有重要意義，還可對該類毒素進行有效評估、防控，為其在農作物及其制品、飼料等農業產品中限量標準的制定提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HSA(規格>96%)，美國Sigma-Aldrich公司；AME(規格>99%)、AOH(規格>99%)，新加坡Pribolab公司；乙腈(色譜純)，美國Honeywell公司；Tris(分析純)，美國Bio Basic公司；HCl(分析純)，成都科龍化工試劑公司。

1.2 儀器與設備

F-380熒光分光光度計，天津港東科技發展股份有限公司；UV-1800紫外分光光度計，上海美析儀器有限公司；MOS-500圓二色譜儀，法國Bio-Logic公司；SDC-6恒溫水浴循環，寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-S2恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿有限公司；pHS-25酸度計，上海雷磁儀器有限公司；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司；QL 901渦旋振蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 熒光光譜測定方法

1.3.1.1 穩態熒光光譜法 在1 cm光徑的熒光比色皿中進行光譜掃描，血清白蛋白的濃度固定為5 μmol·L-1， AME/AOH的最終濃度為0、2.5、5、10、15、20 μmol·L-1[16]。控制檢測溫度為25、31、37℃，激發波長為280 nm，掃描速度為240 nm·min-1，激發和發射狹縫均為5 nm，電壓為400 V，增益為3。記錄血清白蛋白在300～550 nm波長下的熒光光譜。校正后的熒光強度計算公式如下[18]：

(1)

式中，Fcor為校正后的熒光強度；Fobs為觀測到的熒光強度；Aex和Aem分別為受試毒素在激發波長和最大發射波長處的吸光度值。

1.3.1.2 3D熒光光譜法 固定血清白蛋白的濃度為5 μmol·L-1，AME和AOH最終濃度為0和20 μmol·L-1。 激發波長為260～320 nm，發射波長為260～400 nm，掃描間隔為2 nm，掃描速度為240 nm·min-1， 激發和發射狹縫均為5 nm，電壓為400 V，增益為3。測定該體系的3D熒光光譜。

1.3.1.3 同步熒光光譜法 固定血清白蛋白的濃度為5 μmol·L-1，AME和AOH濃度為0、2.5、5、10、15、20 μmol·L-1。在激發波長260～320 nm條件下，收集發射波長275～335 nm范圍內的熒光光譜(Δλ=15 nm)。在激發波長250～320 nm條件下，收集發射波長310～380 nm范圍內的熒光光譜(Δλ=60 nm)。掃描速度為240 nm·min-1，激發和發射狹縫均為5 nm，電壓為400 V，增益為3。

1.3.2 相互作用的猝滅常數計算方法 利用Stern-Volmer方程對不同溫度下(25、31、37℃)的熒光猝滅數據進行分析[19-20]。

(2)

式中，F0和F分別代表不存在和存在毒素時血清白蛋白的熒光強度；Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(L·mol-1)；Q為受試毒素的濃度(mol·L-1)；Kq為血清白蛋白的猝滅速率常數(L·mol-1·s-1)；τ0為不存在毒素時血清白蛋白的平均熒光壽命(一般為10-8s)。

1.3.3 相互作用的結合常數計算方法 參照Sun等[21]的方法，在不同溫度下，假設蛋白質P上有n個猝滅劑Q的結合位點，則有以下方程：

nQ+P→QnP

(3)

(4)

如果總的蛋白含量為P0，則有P0=QnP+P，其中P為未結合的蛋白。

(5)

F0和F分別代表不存在和存在猝滅劑時血清白蛋白的熒光強度；Q為受試毒素的濃度(mol·L-1)；Ka為結合常數；n為結合位點數。

1.3.4 相互作用的熱力學參數計算方法 根據van’t Hoff方程計算AOH/AME-HSA結合作用的熱力學參數ΔH和ΔS[22]。

(6)

式中，Ka為相應溫度下的結合常數；R為氣體常數，8.314 J·mol-1·K-1；以lnKa為縱坐標，1·T-1為橫坐標作圖，線性擬合后可得ΔH和ΔS。各溫度下的自由能變化ΔG可由Gibbs方程計算得出：

ΔG=ΔH-TΔS

(7)

1.3.5 相互作用的結合距離測定方法 在不同溫度下，通過以下公式計算HSA(供體)和AOH/AME(受體)之間的結合距離和能量轉移效率[23]：

(8)

式中，F和F0為毒素存在和不存在時血清白蛋白的熒光強度；R0為能量轉移效率為50%時的臨界距離；r為能量供體和受體之間的結合距離。

(9)

式中，K2為偶極子的空間取向因子；N為介質的平均折射率；φ為供體的熒光量子產率；J為供體熒光發射光譜和受體紫外吸收光譜的重疊積分。對于HSA，K2=2/3，N=1.336，φ=0.118。

(10)

式中，F(λ)為供體在波長λ處的熒光強度；ε(λ)為受體在波長λ處的消光系數。

1.3.6 圓二色光譜測定方法 在不同溫度下，使用0.1 mm的石英比色皿，HSA濃度為10 μmol·L-1，在與AME/AOH的濃度比為1∶0、1∶1、1∶2、1∶3條件下測定圓二色譜數據。掃描間隔1 nm，帶寬2 nm，采集持續時間1 s，測定波長為200～250 nm。每個樣品測定3次取平均值。使用以下公式將數據單位轉換為平均殘留橢圓率(mean residue ellipticity，MRE)[24]：

(11)

式中，MRE為平均殘留橢圓率(deg·cm2·d·mol-1)；θobs為儀器測量值(mdeg)；n為蛋白質的殘基數，HSA為584；c為血清白蛋白的濃度(mol·L-1)；l為比色皿光徑(cm)。

通過以下公式計算HSA的α-螺旋含量：

(12)

1.4 數據處理

使用Excel 2019收集和處理數據，使用Origin 2018軟件進行數據分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 AME和AOH與HSA互作類型研究

通過小分子毒物對血清白蛋白內源熒光的猝滅作用可判斷二者之間的互作類型[25]。由圖1可知，隨著AME和AOH濃度的增加(2.5～20 μmol·L-1)，HSA熒光強度逐漸降低，發生明顯熒光猝滅，說明二者發生了相互作用。隨AME毒素濃度的不斷增加，HSA-AME的熒光值不斷增加并在475 nm處顯示一個新熒光峰，可能是由于二者互作發生熒光能量轉移形成了復合物。

圖1 不同濃度AME、AOH存在下HSA的熒光發射光譜Fig.1 Fluorescence emission spectra of human serum albumins in the absence and presence of increasing concentrations of toxins

由表1可知，隨著溫度的升高，AME-HSA和AOH-HSA體系的猝滅常數(quenching constant，Ksv)值和結合常數(association constant,Ka)值及猝滅速率常數(quenching rate constant,kq)均呈下降趨勢，體系的猝滅速率常數Kq均遠大于生物分子的最大擴散速率常數(2×1010L·mol-1·S-1)[25]。表明AME、AOH與HSA發生了靜態猝滅(動態熒光猝滅是由體系中分子碰撞造成，表現為Ksv隨溫度的升高而升高)，并形成了復合物。除AOH-HSA在25℃結合下的KsvKa。表明AME與HSA具有更強的親和力，導致AME在體內具有較強的毒性作用，這可能是由于AME極性較低，通過疏水相互作用與蛋白質疏水性空腔產生更強的結合能力。

表 1 不同溫度下AME/AOH-HSA相互作用的猝滅常數Table 1 The quenching constants for serum albumins and toxins interaction at different temperatures

2.2 AME和AOH與血清白蛋白互作的結合位點數和結合距離

由圖2和表2可知，在所研究的溫度(25、31、37℃)下，兩種毒素與HSA可形成1∶1復合物，且隨著溫度的升高，結合位點數逐漸降低，說明兩者結合程度逐漸降低。AME(r1=2.56 nm)和AOH(r2=2.60 nm)結合距離r<8 nm，且滿足r1

圖2 AME和AOH的紫外光譜與HSA熒光光譜的重疊圖Fig.2 The overlap of the UV absorption spectrum of toxins with the fluorescence emission spectrum of human serum albumins

表 2 AME和AOH-HSA相互作用的能量轉移參數及不同溫度下的結合位點數Table 2 Energy transfer parameters and the number of binding sites for for serum albumins and toxins interaction at different temperatures

2.3 AME和AOH與HSA互作結合過程中的作用力

由表3可知，所有相互作用體系中的ΔG均小于0，表明結合反應是自發進行的；ΔH<0，ΔS<0，表明兩種毒素與HSA的結合作用力主要為氫鍵和范德華力。隨著溫度升高，AME和AOH與HSA相互作用的ΔG逐漸降低，氫鍵和范德華力削弱[27]。

表3 不同溫度下AME和AOH與HSA相互作用的熱力學參數Table 3 Thermodynamic parameters for HSA and AME and AOH interaction at different temperatures

2.4 AME/AOH對HSA上結合位置微環境的影響

由表4和圖3可知，AME、AOH的加入可與HSA形成復合物，表現為峰1(瑞利散射峰：λex=λem)和峰2(Trp、Tyr和Phe的重疊熒光峰)熒光強度下降。而兩者的加入并未使Tyr殘基最大發射波長藍移，圖4-B、D顯示Trp殘基發生了藍移(AME藍移1 nm，AOH藍移1.4 nm)，表示AME和AOH可使Trp殘基微環境疏水性增加，極性降低，說明兩者與HSA的結合位置更靠近Trp殘基，并推測可能位于結合位點I(亞結構域IIA)的空腔中，可針對該結合位點研究AME、AOH的毒性干預措施。

2.5 AME/AOH對血清白蛋白結構的影響

由圖4可知，隨著AME和AOH的加入，HSA的CD光譜峰形位置未發生明顯變化，表明HSA仍然以α-螺旋結構為主；與HSA∶AME=1∶0相比，在208 nm和222 nm處的峰強度逐漸增大，表明AME、AOH與HSA的結合會導致α-螺旋結構減少，使α-螺旋含量從48.93%分別減少至39.41%和44.01%，同時AME、AOH的加入會使HSA的二級結構發生改變，在相同濃度下，AME可更大程度地改變HSA結構。

表4 HSA和AME/AOH相互作用前后的3D熒光特征參數Table 4 Three-dimensional fluorescence spectral characteristics for serum albumins and toxins interaction

圖3 不同濃度的AME和AOH存在下HSA的同步熒光光譜Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of human serum albumins in the absence and presence of increasing concentrations of AME and AOH

注：A：HSA-AME；B：HSA-AOH；HSA濃度：10 μmol·L-1；AME和AOH濃度：0、10、50 μmol·L-1。Note: A: HSA-AME. B: HSA-AOH. The concentration of HSA: 10 μmol·L-1. The concentrationof AME and AOH: 0,10,50 μmol·L-1.圖4 不同比例AME和AOH存在下HSA的圓二色光譜Fig.4 CD spectra of human serum albumins in the absence of toxins

3 討論

鏈格孢霉毒素是一種廣泛存在于農產品及其相關制品中的一類毒素，研究其與人血清白蛋白的結合方式及結合位點，可以進一步了解該毒素在體內的代謝作用。本研究發現，AME/AOH與HSA之間會發生相互作用，并形成一種1∶1復合物，表明毒素在進入體內后有與人體內血清白蛋白結合的可能，并隨著血液轉運到身體的其他器官、組織中，發揮毒性作用。本研究還發現兩種毒素與HSA在色氨酸殘基附近結合，位于結合位點I(亞結構域IIA)的空腔中，對其結合位置的確定可為鏈格孢霉毒素減毒技術的研究提供參考。此外，對比發現AME與HSA之間有更強的結合力，反映出AME可能在體內有更長的半衰期并發揮持續毒性作用，比AOH更易轉運到機體各處。Ma等[28]和Li等[29]分別利用玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)與血清白蛋白[牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和HSA]發生互作，發現兩種毒素均通過靜態機制猝滅血清白蛋白熒光，并通過疏水作用力和靜電相互作用發生互作，且會改變血清白蛋白的二級結構，這與本研究中AOH和AME可改變HSA二級結構的結果相似。這些研究表明，不同真菌毒素與血清白蛋白之間會發生不同的交互作用，有利于深層次探索真菌毒素毒性，但鏈格孢霉毒素的具體結合位置、結合方式及體內毒性還需進一步深入研究。

目前鏈格孢霉毒素在農作物及其制品中的限量標準尚不完善。本研究明確了二苯-α-吡喃酮類鏈格孢霉毒素與HSA之間的互作過程及機理，有利于進一步了解該類毒素進入體內的轉運、代謝等毒動力過程，補充和完善鏈格孢霉毒素相關毒理學資料，并為該類毒素在農作物及糧食制品中限量標準的制定提供依據，對有效防治該類毒素在農業中的污染，減少經濟損失具有重要意義。

4 結論

本試驗利用穩態熒光光譜、3D熒光光譜、同步熒光光譜以及圓二色光譜等方法研究AME和AOH與HSA的相互作用，結果表明，AME和AOH通過靜態猝滅與HSA發生相互作用，以氫鍵和范德華力作用形成1∶1復合物，且兩種毒素的結合會使HSA二級結構以及色氨酸殘基微環境改變，結合位點更可能位于色氨酸殘基所在的空腔(HSA亞結構域IIA 結合位點I)；其中AME對HSA的猝滅程度更大，結合距離也更近，AME與HSA之間表現出更強的親和力，表明其在體內可能會有更長的毒性作用時間。