高比活度碳-14標記氟噻草胺的合成與分析

王國通 宋明鈺 楊征敏 周 兵

(上海啟甄同位素標記合成研究中心，上海 201403)

氟噻草胺(1,英文名：flufenacet，系統(tǒng)名：N-(4-氟苯基)-N-異丙基-2-((5-(三氟甲基)-1,3,4-噻二唑-2-基)氧基)乙酰胺，圖1)是德國拜耳公司創(chuàng)制的芳氧乙酰胺類除草劑[1]，可抑制植物的細胞分裂和生長[2]，主要用于玉米、大豆、番茄、馬鈴薯和水稻等作物田間的一年生禾本科雜草、莎草及一些小粒闊葉雜草的防控，具有高效、低毒、安全性高等優(yōu)點，可與多種除草劑復配擴大殺草譜[3]。氟噻草胺市場主要分布在歐洲、北美和東南亞部分地區(qū)。當前氟噻草胺在我國的專利保護到期，因其獨特的作用方式和優(yōu)良的復配特性，國內(nèi)科研單位及農(nóng)藥企業(yè)陸續(xù)開展了針對該除草劑的研發(fā)工作和登記代謝試驗[4-8]。

根據(jù)我國2017年9月頒布的《農(nóng)藥登記資料要求》規(guī)定，放射性同位素碳-14標記物是氟噻草胺在農(nóng)作物、環(huán)境和動物中登記代謝試驗所必需的放射性示蹤劑[9-11]。文獻報道了兩種碳-14標記氟噻草胺[12-13]，但未見有關其合成與分析的報道。為滿足我國氟噻草胺登記代謝試驗對放射性示蹤劑的要求，在綜合考慮該藥物的化學穩(wěn)定性、代謝穩(wěn)定性和毒理學重要性等因素后，本研究選擇氟噻草胺分子中具有芳香性的苯環(huán)和噻二唑環(huán)為標記單元，以標記單元中的碳為標記位點(2和3，圖1)。借助標記物(2和3)開展的登記代謝試驗，證實這兩種標記物作為放射性示蹤劑滿足我國農(nóng)藥登記代謝試驗的要求。綜上，本文對這兩種碳-14標記氟噻草胺進行合成與分析(合成路線見圖2、3)，以期為氟噻草胺的同位素示蹤研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圖1 氟噻草胺(1)及其放射性同位素碳-14標記物(2,3)(*表示碳-14標記位點)Fig.1 Flufenacet (1) and its radioisotope carbon-14 labelled counterparts (2,3)(* indicates carbon-14 labelled sites)

圖2 苯環(huán)碳-14標記氟噻草胺(2)的合成路線(*表示碳-14標記位點)Fig.2 Synthetic route of [phenyl-U-14C]flufenacet (2)(* indicates carbon-14 labelled sites)

圖3 [噻二唑環(huán)-2-14C]氟噻草胺(3)的合成路線(*表示碳-14標記位點)Fig.3 Synthetic route of [thiadiazole-2-14C]flufenacet (3)(* indicates carbon-14 labelled sites)

同位素原料4-氟[U-14C]苯胺(比活度2 057.20 MBq·mmol-1，放化純度和化學純度均大于98%)和[14C]硫氰酸鈉(比活度2 049.80 MBq·mmol-1，放化純度和化學純度均大于98%)均為自行制備；閃爍液Optiphase HiSafe 3，購于美國PE公司；高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)和高效液相色譜-質譜(high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)聯(lián)用技術所用甲醇分別為色譜級和質譜級，購于美國Fisher Scientific公司；Milli-Q Advantage A10超純水制備儀，購于默克化工技術(上海)有限公司；其他試劑均為市售分析純，溶劑按照文獻[14]的方法純化。

1.2 目標物N-(4-氟[U-14C]苯基)-N-異丙基-2-((5-(三氟甲基)-1,3,4-噻二唑-2-基)氧基)乙酰胺(2,簡稱為苯環(huán)碳-14標記氟噻草胺)的制備

1.2.1 中間體4-氟-N-異丙基[U-14C]苯胺(5)的合成 在0～5℃下，將4-氟[U-14C]苯胺 (4,28.3 mg,514.30 MBq)、丙酮(21.8 mg)與乙酸(2 mL)混合，攪拌20 min后加入NaBH4(19 mg)[15]，繼續(xù)攪拌。在線放射性高效液相色譜-二極管陣列檢測器串聯(lián)質譜(HPLC-FSA/PDA/MS，簡稱HFPM：Waters Alliance e2695 HPLC-AIM ν.ARC FSA/Waters 2998 PDA/Waters Acquity QDa MS多檢測器聯(lián)用系統(tǒng)與HPLC-PDA/MS系統(tǒng)購于美國沃特世公司，F(xiàn)SA購于美國AIM Research公司)監(jiān)測顯示，反應1 h原料(4)消耗完畢。以飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)反應液pH值至8，經(jīng)乙酸乙酯(ethyl acetate，EA)萃取(30 mL×5)、飽和食鹽水洗滌、無水硫酸鈉干燥和減壓脫溶得黃色液體4-氟-N-異丙基[U-14C]苯胺(5,32.9 mg，437.34 MBq,85%)。放射性薄層成像(Radio-TLC)分析：比移值(retention factor value)Rf(5)=0.65；展開劑：V(EA)/V(PE)=1/10(體積比，下同)，PE為石油醚(petroleum ether)。色譜條件：Diamonsil C18色譜柱(5 μm,4.6 mm × 150 mm,美國迪馬公司)；流速1.00 mL·min-1；波長254 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL；梯度洗脫(min/%A)控制：0/20,1/20,10/100,13/100,14/20,15/20。A為甲醇，B為含0.05%甲酸的水溶液。下文如無特殊說明，HPLC分析均使用此條件。

1.2.2 中間體2-氯-N-(4-氟[U-14C]苯基)-N-異丙基乙酰胺(6)的合成 在氬氣保護和冰-水浴冷卻下，將氯乙酰氯(36.5 mg)滴入4-氟-N-異丙基[U-14C]苯胺(5,32.9 mg,437.30 MBq)和三乙胺(42.9 mg)的無水二氯甲烷(dichloromethane,DCM，5 mL) 溶液中，滴加完畢撤去冰-水浴，自然升至室溫[16]。HFPM監(jiān)測顯示，室溫攪拌0.5 h原料(5)消耗完畢。以水(10 mL )淬滅反應，反應混合液經(jīng)DCM(30 mL×5)萃取、飽和食鹽水洗滌、無水硫酸鈉干燥、減壓脫溶和快速硅膠柱層析[V(EA)/V(PE)=1/3]純化得黃色液體2-氯-N-(4-氟[U-14C]苯基)-N-異丙基乙酰胺(6,46.5 mg,415.14 MBq,95%)。Radio-TLC分析：Rf(6)=0.54；展開劑：V(EA)/V(PE)=1/5。產(chǎn)物(6)在HFPM中的保留時間為7.734 min。梯度洗脫(min/%A)控制：0/50,1/50,10/100,12/100,13/50,15/50；其余條件同1.2.1。

1.2.3 中間體2-((4-氟[U-14C]苯基)(異丙基)氨基)-2-氧乙基乙酸酯(7)的合成 在氬氣保護和室溫下，將2-氯-N-(4-氟[U-14C]苯基)-N-異丙基乙酰胺 (6,46.5 mg,415.14 MBq)、NaOAc(32.5 mg)和四丁基溴化銨(縮寫為TBAB,6.5 mg)溶于甲苯(2 mL)，升溫至110℃，繼續(xù)攪拌[17]。HFPM監(jiān)測顯示，反應1 h原料(6)消耗完畢。體系降至室溫，加水(10 mL )淬滅反應，反應混合物經(jīng)EA(20 mL×5)萃取、飽和食鹽水洗滌、無水硫酸鈉干燥和減壓脫溶得黃色液體2-((4-氟[U-14C]苯基)(異丙基)氨基)-2-氧乙基乙酸酯 (7,45.9 mg,373.70 MBq,90%)。Radio-TLC分析：Rf(7) = 0.65；展開劑：V(EA)/V(PE) = 1/6，重復展開2次。產(chǎn)物(7)在HFPM中的保留時間為7.084 min。色譜條件同1.2.2。

1.2.4 中間體N-(4-氟[U-14C]苯基)-2-羥基-N-異丙基乙酰胺(8)的合成 在氬氣保護和室溫下，將2-((4-氟[U-14C]苯基)(異丙基)氨基)-2-氧乙基乙酸酯 (7,45.9 mg,373.70 MBq)、NaOH(14.5 mg)、乙醇(0.5 mL)和水(0.5 mL)混合，升溫至70℃,繼續(xù)攪拌[18]。HFPM監(jiān)測顯示，反應1 h原料(7)消耗完畢。體系降至室溫，減壓脫除乙醇，加水(5 mL)稀釋，混合液經(jīng)DCM(20 mL×5)萃取、無水硫酸鈉干燥和減壓脫溶得黃色固體N-(4-氟[U-14C]苯基)-2-羥基-N-異丙基乙酰胺 (8,38.5 mg,336.33 MBq,90%)。Radio-TLC分析：Rf(8)=0.55；展開劑：V(EA)/V(PE) =1/3，重復展開2次。產(chǎn)物(8)在HFPM中的保留時間為5.977 min。色譜條件同1.2.2。

1.2.5 苯環(huán)碳-14標記氟噻草胺(2)的合成 在氬氣保護和冰-水浴冷卻下，將2-氯-5-(三氟甲基)-1,3,4-噻二唑(61 mg)滴入N-(4-氟[U-14C]苯基)-2-羥基-N-異丙基乙酰胺 (8,38.5 mg,336.33 MBq)、NaOH(500 mg)、甲苯(4 mL)與水(0.5 mL)的混合液中，滴加完畢繼續(xù)攪拌[3]。HFPM監(jiān)測顯示，反應1 h原料(8)消耗完畢。加水(5 mL)稀釋，混合液經(jīng)EA(20 mL×5)萃取、飽和食鹽水洗滌、無水硫酸鈉干燥和快速硅膠柱層析[V(EA)/V(PE)=1/8]純化得放射性白色固體(2,35.45 mg,201.65 MBq,60%)。Radio-TLC分析：Rf(2)=0.50；展開劑：V(EA)/V(PE)=1/3， 連續(xù)展開3次。產(chǎn)物(2)在HFPM中的保留時間8.234 min。梯度洗脫(min/%A)控制：0/60,1/60,10/100,11/100,13/60,15/60；其余條件同1.2.1。

1.3 目標物N-(4-氟苯基)-N-異丙基-2-((5-(三氟甲基)-1,3,4-[2-14C]噻二唑-2-基)氧基)乙酰胺(3,簡稱為噻二唑環(huán)碳-14標記氟噻草胺)的制備

1.3.1 中間體2-(丙-2-亞烷基)肼基-1-[14C]碳硫酰胺(10)的合成 在氬氣保護和室溫下，將[14C]硫氰酸鈉(9,83 mg,2 049.80 MBq)、硫酸肼(130 mg)溶于水(5 mL)和丙酮(0.1 mL)混合液，升溫至110℃，繼續(xù)攪拌。HFPM監(jiān)測顯示，攪拌4 h原料(9)消耗完畢。體系降至室溫，靜置2 h，于4℃下過夜析晶，獲得白色晶體2-(丙-2-亞烷基)肼基-1-[14C]碳硫酰胺 (10,66 mg,1 024.90 MBq,50%)。產(chǎn)物(10)在HFPM中的保留時間為5.023 min。梯度洗脫(min/%A)控制：0/20,1/20,10/60,13/60,15/20；其余色譜條件同1.2.2。

1.3.2 中間體氨基[14C]硫脲(11)的合成 在氬氣保護和室溫下，將2-(丙-2-亞烷基)肼基-1-[14C]碳硫酰胺(10,66 mg,1 024.90 MBq)的水(5 mL)溶液在攪拌下升溫至115℃。HFPM 監(jiān)測顯示，繼續(xù)攪拌5 h原料(10)消耗完畢。減壓脫水得白色固體氨基[14C] 硫脲 (11,28 mg,614.94 MBq,60%)，直接進行下一步。

1.3.3 中間體5-(三氟甲基)-1,3,4-[2-14C]噻二唑-2-胺(12)的合成 在氬氣保護和室溫下，將三氟乙酸(0.08 mL,1.05 mmol)、三氯氧磷(0.2 mL) 依次滴入攪拌的氨基[14C]硫脲(11,28 mg,614.94 MBq)的甲苯(2.5 mL)溶液，升溫至80℃。HFPM監(jiān)測顯示，繼續(xù)攪拌5 h原料(11)消耗完畢。體系降至室溫，以冰水淬滅反應；以20% NaOH溶液將體系pH值調(diào)至8，經(jīng)乙酸乙酯(20 mL×5)萃取、無水硫酸鈉干燥、減壓脫溶和快速硅膠柱層析(V(EA)/V(PE)=1/2)純化得白色固體5-(三氟甲基)-1,3,4-[2-14C]噻二唑-2-胺(12,46 mg,553.52 MBq,90%)。Radio-TLC分析：Rf(12)=0.45；展開劑：V(EA)/V(PE) = 1/2。產(chǎn)物(12)在HFPM中的保留時間為4.101 min。

1.3.4 中間體2-溴-5-三氟甲基-1,3,4-[2-14C]噻二唑(13)的合成 在氬氣保護和室溫下，將5-(三氟甲基)-1,3,4-[2-14C]噻二唑-2-胺(12,50 mg,553.52 MBq)、溴化銅(80 mg)和亞硝酸叔丁酯(50 mg)與乙腈溶液(4 mL)混合，攪拌，升溫至65℃。HFPM監(jiān)測顯示，反應3 h原料(12)消耗完畢[19]。體系降至室溫，以15%鹽酸(15 mL)淬滅反應，反應混合物經(jīng)甲苯(20 mL×5)萃取、無水硫酸鈉干燥和減壓脫溶得淡黃色液體2-溴-5-三氟甲基-1,3,4-[2-14C]噻二唑 (13,50.5 mg,442.89 MBq)。Radio-TLC分析：Rf(13) =0.60；展開劑：V(EA)/V(PE) =1/3。產(chǎn)物(13)在HFPM中的保留時間為6.291 min。

1.3.5 目標物噻二唑環(huán)碳-14標記氟噻草胺(3)的合成 在氬氣保護和冰-水浴冷卻下，將2-溴-5-三氟甲基-1,3,4-[2-14C]噻二唑 (13,50.5 mg,442.89 MBq)滴入N-(4-氟苯基)-2-羥基-N-異丙基乙酰胺(14,68 mg)和NaOH(500 mg)的甲苯(4 mL)和水(0.5 mL)混合液，滴加完畢后維持此溫度攪拌[3]。HFPM監(jiān)測顯示，繼續(xù)攪拌1 h原料(3)消耗完畢。向反應混合物加水(5 mL)稀釋，經(jīng)EA(20 mL×5)萃取、飽和食鹽水(10 mL×3)洗滌、無水硫酸鈉干燥和快速硅膠柱層析(V(EA)/V(PE) =1/8)純化得白色固體 (3,51 mg,287.86 MBq)。Radio-TLC分析：Rf(3) = 0.50；展開劑：V(EA)/V(PE) =1/3，連續(xù)展開3次。產(chǎn)物(3)在HFPM中的保留時間為8.241 min。色譜條件同1.2.5。

1.4 同位素標記物的質量指標分析

同位素標記物(2)和(3)的質量指標主要包括化學純度、放化純度和比活度，具體分析測定方法如下。

1.4.1 化學純度的測定 將標記物(2)和(3)分別配置濃度為4、6、8 μg·mL-1的甲醇標準溶液，參照文獻[20-21]以外標法測定其化學純度，HPLC色譜條件：XBridge C18 色譜柱(5 μm,4.6 mm × 250 mm,美國迪馬公司)；流速1 mL·min-1；波長254 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL；梯度洗脫(min/%A)控制：0/40,1/40,45/100,50/100,55/40,60/40；A為甲醇，B為含0.05%甲酸的水溶液。

1.4.2 放化純度的測定 采用放射性薄層成像分析法(TLC-IIA)(Eckert & Ziegler AR-2000薄層放射性掃描儀，德國Eckert & Ziegler公司)和Waters Alliance e2695 HPLC-AIM ν.ARC FSA在線放射性高效液相色譜(HPLC-FSA)分別測定標記物(2)和(3)的放化純度[22-23]。

TLC-IIA分析：標記物(2)、(3)和氟噻草胺標樣在同一硅膠層析薄板(5 mm×20 mm)上展開，其比移值(Rf)均為0.67。TLC條件：V(EA)/V(PE)=1/3，連續(xù)展開4次。

HPLC-FSA分析：色譜條件同1.4.1；PerkinElmer Tri-Carb 4910TR流動液體閃爍測量儀(美國PE公司)，使用Optiphase HiSafe 3閃爍液，其流速為8.00 mL·min-1。標記物(2)和(3)在HPLC-FSA色譜圖中均顯示1個具有放射性特征的規(guī)則色譜峰。

1.4.3 比活度的測定 用微量注射器分別精確移取標記物(2)和(3)的溶液(10 μL,0.01 μg·mL-1)各6份，用液體閃爍測量儀測量其放射性活度，根據(jù)測量結果計算比活度[22-23]。

2 結果與分析

本研究以4-氟-[U-14C]苯胺和[14C]硫氰酸鈉為同位素原料，分別經(jīng)五步放化反應制備了放射性同位素碳-14標記物(2)和(3)，其放化總收率分別為39%和14%。通過1H NMR (Varian 400 MHz 核磁共振儀，以TMS為內(nèi)標)和ESI-MS (Waters Alliance e2695 HPLC-Acquity Qda MS/Waters 2998 PDA)分別對各產(chǎn)物進行表征，表征數(shù)據(jù)如下：

4-氟-N-異丙基[U-14C]苯胺(5)：1H NMR (400 MHz,DMSO-d6),δ: 6.92 - 6.83 (m,2 H,Ar-H),6.51 (ddd,J= 6.7,5.3,2.9 Hz,2 H,Ar-H),5.22 (d,J= 8.1 Hz,1 H,NH),3.52 - 3.39 (m,1 H,CH),1.09 (d,J= 6.3 Hz,6 H,CH3)。ESI-MSm/z: 156[M+H]+。

2-氯-N-(4-氟[U-14C]苯基)-N-異丙基乙酰胺(6)：1H NMR (400 MHz,DMSO-d6),δ: 7.40 - 7.23 (m,4 H,Ar-H),4.79 - 4.68 (m,1 H,CH),3.79 (s,2 H,CH2),0.96 (t,J= 8.4 Hz,6 H,CH3)。ESI-MSm/z: 232[M+H]+,254[M+Na]+。

2-((4-氟[U-14C]苯基)(異丙基)氨基)-2-氧乙基乙酸酯(7)：1H NMR (400 MHz,CDCl3)，δ：7.19-7.11 (m,4 H),4.94 (tt,J= 6.8,6.8 Hz,1 H),4.18 (s,2 H),2.12 (s,3 H),1.05 (d,J= 6.8Hz,6 H)。ESI-MSm/z: 256[M+H]+。

N-(4-氟[U-14C]苯基)-2-羥基-N-異丙基乙酰胺(8)：1H NMR (400 MHz,DMSO-d6),δ: 7.33 - 7.20 (m,4 H,Ar-H),4.77 (dt,J= 13.4,6.6 Hz,1 H,CH),4.45 (t,J= 5.7 Hz,1 H,OH),3.47 (d,J= 5.6 Hz,2 H,CH2),0.95 (d,J= 6.8 Hz,6 H,CH3)。ESI-MSm/z: 214[M+H]+，236[M+Na]+。

目標物苯環(huán)碳-14標記氟噻草胺(2)：1H NMR (400 MHz,DMSO-d6),δ: 7.41 (dd,J= 8.6,5.2 Hz,2 H,Ar-H),7.35 (t,J= 8.6 Hz,2 H,Ar-H),4.77 (s,2 H,CH2),4.72 (dd,J= 13.5,6.8 Hz,1 H,CH),0.98 (d,J= 6.8 Hz,6 H,CH3)。19F NMR (76 MHz,CDCl3) δ: -58.36 (s,3F),-108.74 ～ -109.08 (m,1F)。ESI-MSm/z: 196,388 [M+Na+2]+。

2-(丙-2-亞烷基)肼-1-[14C]碳硫酰胺(10)：1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)，δ: 9.89 (s,1 H,NH),7.98 (s,1 H,NH2),7.50 (s,1 H,NH2),1.91 (s,3 H,CH3),1.90 (s,3 H,CH3)。ESI-MSm/z: 134[M+Na]+。

5-(三氟甲基)-1,3,4-[2-14C]噻二唑-2-胺(12)：1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ：8.03 (s,2 H);19F NMR (76 MHz,DMSO-d6) δ：-56.50 (s,3F)。ESI-MSm/z: 172[M+H]+。

2-溴-5-三氟甲基-1,3,4-[2-14C]噻二唑(13)：19F NMR (76 MHz,DMSO-d6) δ: -56.64 (s,3F)。EI-MSm/z: 234[M+2]+,236[M+2+2]+。

目標物噻二唑環(huán)碳-14標記氟噻草胺(3)：1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 7.40 (dd,J= 8.6,5.1 Hz,2 H,Ar-H),7.38 (t,J= 8.6 Hz,2 H,Ar-H),4.77 (s,2 H,CH2),4.72 (dd,J= 13.5,6.8 Hz,1 H,CH),0.99 (d,J= 6.8 Hz,6 H,CH3)。19F NMR (76 MHz,CDCl3) δ: -58.36 (s,3F),-108.74 ～ -109.08 (m,1F)。ESI-MSm/z: 194,388[M+Na+2]+。

TLC-IIA分析顯示，標記物(2)和(3)經(jīng)展開后在硅膠薄板上均顯示1個具有放射性特征的斑點，且該斑點形狀和比移值與同一硅膠板上同時展開的氟噻草胺標樣(UV顯色)一致，表明標記物(2)和(3)中均僅含有1種放射性碳-14標記氟噻草胺。HPLC-FSA分析顯示，標記物(2)和(3)的放化純度均大于98%(圖4)，與TLC-IIA分析結果一致。HPLC外標法定量分析顯示，標記物(2)和(3)的化學純度均大于98%。根據(jù)LSC分析結果計算可知，兩種標記物的比活度分別為2 049.80 MBq·mmol-1和2 042.40 MBq·mmol-1，其總活度分別為201.65 MBq和287.86 MBq。

圖4 兩種碳-14標記氟噻草胺(2,3)的在線放射性高效液相色譜圖Fig.4 Online radio-chromatogam (HPLC-LSC) of carbon-14 labelled flufenacet (2,3)

在核磁共振氫譜中，標記物(2)和(3)上氫原子的化學位移、峰型和耦合常數(shù)與氟噻草胺標樣基本一致[24-25]。氟噻草胺(1)的精確相對分子質量為363[M]，其標樣質譜圖中典型碎片離子峰和加合離子峰對應的質核比分別為194和386[363+Na]+。標記物(2)質譜圖(圖5)中典型碎片離子峰和加合離子峰對應的質核比(m/z)分別為196[194+2]和388[M+Na+2]+，其中m/z196表明標記核素碳-14處于氟噻草胺的典型離子碎片中，加合離子m/z388與363[M]的差值進一步驗證了標記物(2)中含有碳-14。標記物(3)質譜圖(圖5)中典型碎片離子峰和加合離子峰對應的質核比(m/z)分別為194(與氟噻草胺典型離子碎片質核比一致，其中不含碳-14)和388[M+Na+2]+，其中兩種加合離子m/z388與363[M]的差值進一步印證了標記物(3)中存在碳-14。標記物(2)和(3)在HPLC中的保留時間均為26.355 min，與氟噻草胺標樣在相同色譜條件下的保留時間一致。結合標記物的合成路線、氫譜數(shù)據(jù)、質譜特征、HPLC保留時間和物質放射性特性，可以確定標記物(2)和(3)分別為N-(4-氟[U-14C]苯基)-N-異丙基-2-((5-(三氟甲基)-1,3,4-噻二唑-2-基)氧基)乙酰胺和N-(4-氟-苯基)-N-異丙基-2-((5-(三氟甲基)-1,3,4-[2-14C]噻二唑-2-基)氧基)乙酰胺。

圖5 兩種碳-14標記氟噻草胺(2和3)的電噴霧電離-質譜圖Fig.5 Mass spectrum of two carbon-14 labelled counterparts (2 and 3) of flufenacet (ESI-MS)

圖6 氟噻草胺(1)的常見合成技術路線匯總Fig.6 Summary of common synthetic routes of flufenacet (1)

3 討論

在農(nóng)藥碳-14標記合成時，標記位點的選擇是首要考慮的問題。按照我國現(xiàn)行法規(guī)要求，碳-14標記通常要求對農(nóng)藥分子的碳骨架進行標記，且優(yōu)先考慮對碳環(huán)標記[9-11]。本研究以氟噻草胺分子中具有芳香性的苯環(huán)和噻二唑環(huán)為標記單元，從標記的可行性、難易程度和成本等角度選取標記單元中適當?shù)奶紴闃擞浳稽c，相應的兩種標記物(2和3)中碳-14標記牢固而不易脫落，可滿足我國農(nóng)藥登記代謝試驗對標記物的要求。

在合成標記物(2)的模擬冷反應(圖6)中，2-氯-N-(4-氟苯基)-N-異丙基乙酰胺(15)與碳酸鈉在水與N-甲基吡咯烷酮(縮寫為NMP)混合液中加熱一步反應可獲得中間體N-(4-氟苯基)-2-羥基-N-異丙基乙酰胺(14)[26]；中間體(15)與醋酸鈉發(fā)生酯化反應，所得酯(16)經(jīng)堿性水解或者酯交換也可獲得中間體(14)[27]。相比較而言，前法通過一步反應可獲得中間體(14)，看似為最理想的標記方法，但試驗證實該法所得微量液態(tài)產(chǎn)物(14)中夾雜的超微量高沸點溶劑NMP難以除去而引起后續(xù)反應收率降低，甚至反應失敗；盡管后法經(jīng)兩步反應獲得中間體(14)，但這兩步的反應條件溫和，后處理簡單，反應收率近乎定量，因而標記合成中標記中間體(6)經(jīng)兩步反應來制備(8)。中間體(8)通過與2倍量的2-氯-5-(三氟甲基)-1,3,4-噻二唑反應而完全轉化。

在合成標記物(3)的模擬冷反應(圖6)中，噻二唑類化合物通常經(jīng)肼基二硫代甲酸甲酯(18)或氨基硫脲與三氟乙酸關環(huán)制備。二硫化碳和三氟乙酸均為低沸點易揮發(fā)物質，使用這兩種物質對應的含碳-14合成砌塊制備噻二唑均存在因揮發(fā)而引起內(nèi)照射的潛在風險，因而本研究放棄了經(jīng)過(18)制備2-甲硫基-5-三氟甲基-1,3,4-噻二唑(19)，以雙氧水或過硫酸鹽氧化為2-甲砜基-5三氟甲基-1,3,4-噻二唑(17a)的技術路線[28]，而以無機鹽[14C]硫氰酸鈉(9)為起始同位素原料，后續(xù)制備的含碳-14中間體(10～12)均為固體，中間體(13)為難揮發(fā)物質，與這些含碳-14中間體反應所涉及的揮發(fā)性物質均為非放射性原料，因而在標記合成過程中不存在因放射性物質揮發(fā)而帶來內(nèi)照射的風險。氨基[14C]硫脲(11)與三氟乙酸、三氯氧磷反應關環(huán)獲得5-(三氟甲基)-1,3,4-[2-14C]噻二唑-2-胺(12)。為了提高(12)的轉化率，本研究通過經(jīng)亞硝酸叔丁酯重氮化反應使中間體(12)轉化為活性更高的噻二唑溴代物2-溴-5-三氟甲基-1,3,4-[2-14C]噻二唑(13)；在堿性條件下，中間體(13)與1.5倍量的(14)反應可獲得目標物(3)[29]。

4 結論

本研究以4-氟[U-14C]苯胺和[14C]硫氰酸鈉為起始同位素原料，通過多步放射合成反應分別制備了苯環(huán)碳-14標記氟噻草胺(2)和噻二唑環(huán)中2-位碳-14標記氟噻草胺(3)，其化學純度和放化純度均大于98%，比活度分別為2 049.80 MBq·mmol-1和2 042.40 MBq·mmol-1，總活度分別為201.65 MBq和287.86 MBq。兩種碳-14標記氟噻草胺均可作為放射性示蹤劑，用于氟噻草胺的同位素示蹤研究，包括該除草劑在我國的登記代謝試驗。