銅胺氧化酶基因PpCuAO4在桃成熟中的功能鑒定

王 偉 程 鑫 崔振國 蔣亞博 譚 彬 程 鈞 張郎郎 馮建燦

(河南農業大學園藝學院/河南省果樹瓜類生物學重點實驗室，河南 鄭州 450002)

桃(PrunuspersicaL.)果實味道鮮美，營養豐富，是一種深受人們喜愛的大眾水果。然而，桃作為一種典型的呼吸躍變型果實，成熟后不耐貯藏，嚴重制約了其產業發展。乙烯是調控桃果實成熟衰老的關鍵植物激素[1]。研究表明，多胺(polyamine)作為一種乙烯作用拮抗劑，能夠延緩桃果實成熟衰老，是一種具有潛力的天然果實貯藏保鮮劑[2]。

多胺是一種小分子脂肪族含氮堿，廣泛存在于自然界各種有機生物體內，包括動物、植物、細菌和真菌等[3]。多胺在植物發育過程中起著至關重要的作用，能夠參與花的分化和發育、葉片發育和衰老、果實發育和成熟、非生物脅迫和生物脅迫應答等眾多生理生化過程[3]。植物體內最常見的3種多胺分別是腐胺(putrescine，Put)、亞精胺(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)[4]。植物多胺的合成起始于Put的合成。植物中Put生物合成主要由精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase，ADC)催化完成[5]。Put合成后作為前體物質在Spd合成酶(spermidine synthase，SPDS)和硫腺苷甲硫氨酸脫羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC)的催化下生成Spd。Spd則進一步在Spm合成酶(spermine synthase，SPMS)和SAMDC的催化下生成Spm[6]。此外，多胺合成代謝路徑與一些其他重要物質代謝路徑相互聯系，構成復雜的代謝網絡。例如，多胺合成與乙烯合成具有相同的前體物質腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmeth-onine)，目前已有許多研究表明增加其中任意一種物質的合成都會影響另外一種物質的合成，但這一觀點還存在爭議[7]。植物體內多胺的氧化分解主要由銅胺氧化酶(copper amine oxidase, CuAO)和多胺氧化酶(polyamine oxidase, PAO)參與完成。CuAO主要催化Put的氧化反應，同時產生氨(NH4+)、4-氨基丁醛(4-aminobutyrate)及過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)等分解產物；4-氨基丁醛進一步轉化為γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)[8]。有研究發現在擬南芥中，CuAO同樣參與Spd的分解代謝[9]。PAO主要參與催化Spd、Spm及其乙?；苌锏姆纸獯x。根據功能可將PAO分為兩類：第一類參與多胺末端分解反應，分解Spd和Spm并產生二氨基丙烷(diaminopropane，Dap)和H2O2等分解產物[4]；第二類參與回復反應，即催化Spm到Spd以及Spd到Put的反應，同時產生H2O2等產物[10]。

有研究報道，在桃果實發育早期和成熟前，采用多胺處理均可延緩桃果實成熟[11-12]。汪開拓等[2]研究發現，采用Spd處理采收后的白鳳水蜜桃可以顯著降低桃果實貯藏期間腐爛率，并且可以促進多胺合成基因PpSAMDC、PpSPDS、PpADC等上調表達，同時抑制乙烯合成關鍵基因PpACS1、PpACO1表達水平，減少乙烯合成，延緩桃果實成熟衰老。此外，劉新婷等[13]發現Spd處理可有效延緩番木瓜果實軟化，顯著降低果實呼吸速率并延緩果實色澤的轉變。除了外源多胺處理，研究發現利用基因工程在番茄中超量表達桃PpADC基因能夠促進轉基因植株Put積累，抑制赤霉素合成，最終導致植株生長矮化，開花和結果延遲[14]。另一方面，通過抑制內源多胺分解，同樣可以延緩果實成熟。有研究發現采用PAO抑制劑處理可以顯著延緩葡萄和桃果實成熟[11,15-16]。

在果實發育前期，多胺含量一般較高，隨著果實的發育和成熟，多胺含量逐漸降低，并且該現象在呼吸躍變型和呼吸非躍變型果實中普遍存在[17-18]。研究發現，在富士蘋果花后30～80 d，Put和Spm含量均呈現下降趨勢[18]。番茄中的研究發現在果實快速發育階段多胺合成基因SPMS和分解基因CuAO表達水平均顯著升高，并且CuAO基因從破色期到成熟期均維持高表達水平，而SPDS1基因表達量在果實完熟期達到高峰[19]。進一步研究發現，與SlSPMS、SlADC和SlODC在成熟期的較低表達水平相比，SlSPDS2在番茄果實成熟中可能發揮主要作用[20]。前期研究發現，黃水蜜桃中Put、Spd和Spm含量均隨著果實成熟逐漸降低，與此同時多胺合成關鍵基因PpADC、PpSPDS和多胺氧化酶基因PpPAO1表達水平均顯著升高，PpPAO1介導的Spd和Spm的氧化分解直接導致多胺積累降低[11]。研究報道多胺分解產生的H2O2是一種信號分子，能夠誘導果實成熟和逆境應答[21]。河南農業大學桃生物學與種質創新團隊前期研究發現桃中有4個CuAO基因，分別是PpCuAO1～PpCuAO4，其中PpCuAO4介導的Put分解是導致桃果實發育和成熟過程中多胺積累降低的重要原因[22]。然而，CuAO介導的多胺分解在桃果實成熟中的作用，尤其是PpCuAO4在桃果實成熟中的功能仍然不清楚?；诖耍狙芯坎捎肅uAO抑制劑處理驗證CuAO介導的多胺分解在桃果實成熟過程中的作用，同時利用病毒誘導的基因沉默技術(virus induced gene silence，VIGS)分析PpCuAO4在桃果實成熟中的功能，旨在為進一步深入研究多胺調控桃果實成熟的機制提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料選擇種植在鄭州市惠濟區河南農業大學科教園區的7年生黃水蜜桃，采用獨立主干樹形，株行距為1.5 m×3.5 m，常規田間管理。黃水蜜桃為軟溶質桃，成熟期在7月初，成熟后迅速出現呼吸高峰和乙烯釋放高峰，果肉迅速軟化。

1.2 試驗方法

1.2.1 CuAO抑制劑處理 選取樹齡大小一致和果實負載量適中的黃水蜜桃樹，每株樹從東、南、西、北4個方向隨機選擇4個枝條，選取生長狀態及成熟度一致(均處于果實第二次膨大期)的桃果實各100個，在花后90 d分別用含0.1% Tween 20的1.0、5.0和10.0 mmol·L-1CuAO抑制劑氨基胍(aminoguanidine，AG)對桃果實進行噴施處理，每7 d噴施1次，連續噴施2次，同時采用含 0.1% Tween 20的清水處理作為對照。在桃果實成熟后采摘處理果實，于25℃黑暗條件貯藏，于采收后第0、第3 和第7天測定果實硬度。

1.2.2 VIGS沉默桃果實PpCuAO4基因 利用PCR擴增PpCuAO4基因cDNA非保守區序列，片段大小為325 bp，引物序列見表1。利用同源重組方法將所擴增片段插入到pTRV2載體中，構建完成重組質粒，并轉化根癌農桿菌GV3101菌株。VIGS誘導桃果實基因沉默方法參考文獻[23]，具體方法如下：分別將含有重組質粒和pTRV2空載質粒的農桿菌GV3101菌液，以及含有pTRV1載體的GV3101菌液按體積比1∶1等量混合后，選取花后90 d的黃水蜜桃果實進行接種，利用注射法接種到果實靠近果柄的果肉中，每個果實均選取2處注射，每個混合菌液各注射50個發育狀態一致的果實，注射10 d后采樣。設置3次獨立的生物學重復。

表1 基因克隆及定量分析所用引物序列Table 1 Primers used for gene cloning and qRT-PCR

1.2.3 基因表達分析 以注射針孔所在位置為中心，用手術刀切取半徑約1 cm的侵染區域果實，用于檢測PpCuAO4沉默效率。采用已接種pTRV1、pTRV2和未接種的果實為對照。桃果實總RNA提取參見上海生工柱式植物總RNA提取試劑盒(Spin Column Plant total RNA Purification Kit)說明?？俁NA濃度及純度采用Nanodrop 2000分光光度計(Thermo Scientific, 美國)檢測，然后通過瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性。cDNA合成采用RNA反轉錄試劑盒(TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit，日本)。反轉錄的cDNA于-80℃保存備用。利用實時熒光定量技術(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測PpCuO4及果實成熟相關基因PpACO1、PpACS、PpPIN1、PpGH3.3、PpPG和PpPMEI的表達。所用定量引物序列見表1，以PpEF2作為內參基因?；虮磉_分析采用ABI 7500Fast系統(Applied Biosystems，美國)，運行程序采用95℃預變性5 min，95℃變性30 s，95℃退火3 s，60℃延伸30 s，40個循環，產物于12℃條件下保存?；虮磉_量分析采用2-△△Ct法計算。

1.2.4 桃果實多胺測定 采用乙腈浸提法提取多胺，具體方法如下：取2 g桃果肉于液氮中研磨至粉末，稱取0.5 g粉末，加入2 mL 20%乙腈，于冰水浴中超聲提取30 min；隨后于4℃、10 000×g條件下離心3 min，取上清液，沉淀加入2 mL 20%乙腈再浸提1次；加入乙腈定容至5 mL；4℃、10 000×g條件下離心3 min，取上清液1 mL，采用0.22 μm有機相濾膜過濾，使用po-roshell 120 SB-C18反相色譜柱(Agilent，美國)上機檢測。利用液相質譜(liquid chromatography-electrospray mass spectrometry，HPLC-MS)檢測，流動相A為90%乙腈，流動相B為0.1%甲酸，流速設定為0.3 mL·min-1， 梯度洗脫。自由態多胺含量檢測采用安捷倫1260串聯6420A高效液相質譜(Agilent，美國)聯用法，由南京鐘鼎生物技術有限公司完成。

1.2.5 桃果實成熟相關生理指標測定 果實硬度測定：采用GY-4型壓力測試儀(托普儀器，杭州)測定。

呼吸強度測定：將待測桃果實放入裝有橡皮塞的密封盒子，于室溫條件下密閉1 h后采用OXYBABY 6.0 O2/CO2頂空分析儀(WITT，德國)測定。

乙烯釋放速率測定：將桃果實放入氣密性良好的密封盒子中測量乙烯產量，并在室溫條件下放置1 h，然后取1 000 μL氣體樣品并注入填充GC 2010 Plus氣相色譜儀(Shimadzu, 日本)分析；檢測器為氫火焰檢測器，色譜柱為GDX-502型填充色譜柱；進樣口溫度110℃，色譜柱溫度60℃，檢測器溫度150℃；載氣為氮氣，載氣流速為40 mL·min-1。每個處理重復3次。

1.2.6 數據統計與分析 試驗數據采用Excel 2016和SPSS 17.0進行處理及差異顯著性分析，差異顯著性分析檢驗方法為t檢驗，P<0.05。所用誤差均為標準差(standard deviation, SD)?；虮磉_分析和果實生理指標測定均不少于3次生物學重復。使用SigmaPlot 12.5進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 AG處理延緩桃果實成熟

為了探究CuAO介導的多胺氧化分解在桃果實成熟中的功能，分別采用1、5和10 mmol·L-13種不同濃度的AG處理黃水蜜桃果實。結果顯示，采用5和10 mmol·L-1AG處理果實的硬度在采后第3和第7天不同程度地顯著高于對照水平，并且5 mmol·L-1AG處理的效果更顯著(P<0.001)，而1 mmol·L-1AG處理的桃果實硬度與對照相比均無顯著差異(圖1)。說明AG處理可延緩黃水蜜桃果實軟化，且 5 mmol·L-1AG處理效果最好，因此后續試驗采用5 mmol·L-1AG處理。

注：*、**、***分別表示與對照相比在0.05、0.01、0.001水平上差異顯著。下同。Note: *, **, *** indicate significant differences between the AG treatment and control fruits a 0.05, 0.01, 0.001 level, respectively. The same as following.圖1 不同濃度AG處理黃水蜜桃果實硬度測定Fig.1 The fruit firmness of Huangshuimi peach under the treatment of different concentrations of AG

由圖2-A可知，與對照相比，5 mmol·L-1AG處理后黃水蜜桃果實著色明顯延緩。同時發現桃果實硬度在采后7 d內呈明顯下降趨勢，但AG處理下桃果實硬度在處理第2、第3和第5天仍顯著高于對照水平(圖2-B)。乙烯釋放量測定顯示，桃果實采后乙烯釋放量迅速上升，并在第3天達到高峰，隨后逐漸下降，AG處理下果實乙烯釋放量在前4 d及第7天依然顯著低于對照組(圖2-C)。果實呼吸強度結果顯示，對照組果實呼吸強度在處理第2天略有上升，隨后逐漸下降，而AG處理組桃果實呼吸強度整體呈現逐漸下降趨勢，并且在處理第2至第4天顯著低于對照水平(圖2-D)。綜上所述，5 mmol·L-1AG處理可顯著延緩桃果實軟化速度，降低乙烯釋放量和呼吸速率，從而延緩桃果實成熟。

圖2 5 mmol·L-1AG處理黃水蜜桃果實表型及成熟相關生理數據Fig.2 The phenotype and fruit quality traits of Huangshuimi peach under the treatment of 5 mmol·L-1 AG

2.2 AG處理抑制桃果實成熟相關基因表達

為了進一步解析CuAO抑制劑處理延緩桃果實成熟軟化的分子機理，采用qRT-PCR技術分析AG處理后桃果實乙烯合成、生長素轉運和細胞壁降解相關基因表達水平。結果顯示，AG處理后桃乙烯合成關鍵基因PpACO1和PpACS的相對表達水平在采后第3和第5天均顯著低于對照(圖3-A、B)。同時，生長素轉運和調節相關基因PpPIN1、PpGH3.3以及細胞壁降解相關基因PpPG、PpPMEI的相對表達水平均顯著低于對照(圖3-C～F)。上述結果表明，AG處理可以抑制乙烯合成、生長素轉運和細胞壁降解相關基因表達，從而抑制乙烯合成、生長素轉運和細胞壁降解，延緩桃果實成熟軟化。

圖3 5 mmol·L-1 AG處理黃水蜜桃果實乙烯合成和細胞壁降解相關基因表達分析Fig.3 The expression of ethylene synthesis and cell wall-degrading related genes of Huangshuimi peach under the treatment of 5 mmol·L-1 AG

2.3 沉默PpCuAO4基因延緩桃果實成熟

為進一步驗證PpCuAO介導的多胺分解在桃果實成熟中的功能，采用VIGS技術沉默桃果實PpCuAO4基因，并分析果實成熟相關生理指標。結果顯示，與注射TRV2空載質粒的對照果實相比，轉基因桃果實注射部位呈現淺綠色，而對照果實注射部位著色與未注射部位無明顯差異(圖4-A)?；虮磉_分析顯示，轉基因桃果實PpCuAO4的相對表達水平僅為對照的18%(圖4-B)。多胺含量測定發現，轉基因果實Put含量顯著高于對照組，而Spd和Spm含量略高于對照，但無顯著差異(圖4-C)，說明沉默PpCuAO4后桃果實Put分解被顯著抑制，積累增加。桃果實硬度測定顯示，雖然對照和轉基因桃果實采后硬度呈明顯下降趨勢，但轉基因果實硬度在第1、第2、第3和第5天均顯著高于對照組(圖4-D)。轉基因和對照果實在采后7天內乙烯釋放量均呈現先升高后降低的趨勢，其中在采后第1天達到高峰，隨后逐漸下降，但轉基因果實乙烯釋放量均低于對照水平，尤其是在采后第1天和第2天差異達到顯著水平(圖4-E)。呼吸強度測定結果與乙烯釋放量類似，轉基因和對照桃果實呼吸強度同樣呈先升高后降低的趨勢，在采后第1天達到呼吸高峰，隨后逐漸降低，但轉基因桃果實呼吸強度始終低于對照水平，尤其是在采后第2 d轉基因桃果實呼吸強度顯著低于對照水平(圖4-F)。上述試驗結果充分說明，沉默PpCuAO4基因可顯著抑制Put分解，降低果實軟化速度，同時降低乙烯釋放量和呼吸強度，從而延緩桃果實成熟。

注：A：沉默PpCuAO4基因桃果實表型觀察，TRV2為空載對照；B：轉基因桃果實PpCuAO4表達分析；C：轉基因桃果實自由態多胺含量測定；D～F：分別為轉基因桃果實硬度、乙烯釋放量和呼吸強度測定。 Note: A: Phenotype of PpCuAO4-silenced peach fruit. TRV2 means empty vector. B: Expression level of PpCuAO4 in PpCuAO4-silenced and control peach fruits. C: Free polyamine concentration of PpCuAO4-silenced peach fruit. D～F: The firmness, ethylene release and respiration rate of PpCuAO4-silenced peach fruit, respectively.圖4 VIGS沉默PpCuAO4桃果實表型觀察及生理數據測定Fig.4 The phenotype and detection of fruit quality traits of PpCuAO4-silenced peach fruit

3 討論

現有研究表明外源Spd和Spm處理可以延緩桃和葡萄果實成熟衰老[11-12,15]，但會促進草莓果實成熟[24]，而采用PAO抑制劑處理同樣可以促進草莓果實著色和成熟[25-26]，由此可見多胺對果實成熟的調控作用十分復雜，在不同類型果實可能發揮不同作用。本研究結果表明，采用CuAO抑制劑AG處理能夠延緩桃果實成熟軟化，且呈現一定的濃度梯度效應。為進一步解析CuAO介導的多胺分解影響桃果實成熟的分子機理，本研究分析了AG處理后黃水蜜桃果實乙烯合成、生長素轉運及細胞壁降解相關基因表達水平，結果表明AG處理可顯著抑制乙烯合成、生長素轉運及細胞壁軟化相關基因表達水平。然而，PpCuAO4在桃果實成熟中的功能尚不明晰。由于桃目前尚無穩定的遺傳轉化體系，本研究采用VIGS技術瞬時沉默了桃果實PpCuAO4基因，結果表明敲除PpCuAO4基因后Put積累顯著增加，且采后轉基因桃果實軟化速度明顯延緩，乙烯釋放和呼吸作用均得到顯著抑制。VIGS結果充分說明，PpCuAO4基因能夠通過促進Put分解，從而正調控桃果實成熟。

隨著對多胺調控果實成熟功能研究的不斷深入，多胺在果實采后貯藏保鮮中的應用也受到廣泛關注。其中，采用Put和Spd處理可以顯著改善葡萄貯藏品質[27]，并且可以通過抑制果實的呼吸作用和增加細胞膜透性，延緩果實硬度、可滴定酸、可溶性固形物和抗壞血酸含量的下降，從而保持無核白葡萄貯藏品質[28]；陳志遠等[29-30]發現Spm可以改善藍莓果實貯藏品質，延長貯藏時間。上述研究結果表明，多胺不僅能夠影響果實成熟，而且能夠延緩采后果實衰老和品質劣變，減少病害發生，從而改善貯藏品質，延長貨架期。然而，這些報道均通過施用外源多胺來達到增加多胺積累、延緩成熟衰老的目的，而通過減少果實多胺分解是否能夠達到同樣的效果尚不清楚。本研究通過外源CuAO抑制劑和敲除Put分解關鍵基因PpCuAO4基因均實現了增加Put積累和延緩桃果實成熟的目的，說明CuAO在果實成熟發揮重要作用，并且通過抑制CuAO介導的多胺分解同樣可以延緩果實成熟，延長貨架期。

與此同時，天然多胺提取復雜，且含量較低，而人工合成的多胺使用成本較高，嚴重制約了其在生產過程中的應用[31]。本研究探究了CuAO抑制劑AG處理在延緩桃果實成熟軟化中的效果，結果表明AG處理具有較好的貯藏保鮮效果。同時，AG使用成本低，便于大范圍使用，具有作為果實貯藏保鮮劑使用的潛力。隨著CRISPR/Cas9技術的發展，利用基因工程技術培育高品質、耐貯運的水果新品種正在成為一種趨勢。因此，進一步挖掘多胺調控果實成熟衰老的關鍵基因可為未來作物遺傳改良提供重要的基因資源。

4 結論

本研究采用外源CuAO抑制劑AG處理證實了CuAO介導的多胺分解能夠促進桃果實成熟，并利用VIGS技術進一步證明了PpCuAO4基因可以通過促進Put分解加速桃果實成熟，表明CuAO抑制劑AG具有作為一種桃果實貯藏保鮮劑的應用潛力，同時PpCuAO4可以作為利用生物技術培育耐貯運桃新品種的重要基因資源。