長白豬Plin3、Plin5基因克隆及表達規律研究

李鑫月 郭振清 張 寒 李紅強,2,*

(1 河北科技師范學院動物科技學院，河北 昌黎 066000；2 河北省特色動物種質資源挖掘與創新重點實驗室，河北 昌黎 066000)

豬肉是我國居民的主要肉食來源，其產量在肉類總產量中占主導地位，是我國生產和消費最多的肉類品種。脂肪沉積性狀是養豬生產中重要的經濟性狀，既與生豬生產效率和繁殖性狀密切相關，還影響豬肉品質和消費者對豬肉的選擇。脂肪沉積是一個動態平衡過程，包括脂肪合成、脂肪分解和脂肪轉運等過程。沉積在肌束間和肌纖維間的脂肪，即肌內脂肪，其含量直接影響豬肉的感官品質、風味、多汁性、嫩度和色澤[1]，因此將肌內脂肪含量作為判斷豬肉品質的重要指標之一。

脂滴作為肌內脂肪細胞存儲脂肪的細胞器，受到研究人員的普遍關注。不同組學研究發現，脂滴形成和發育受多種脂肪生成相關基因、轉錄因子以及表觀遺傳因子共同調控。PAT(perilipin-adipophilin-tail interacting protetin of 47 ku)家族蛋白是最早被發現的脂滴相關蛋白，在脂滴合成和分解過程中起作用，包括Plin1、Plin2、Plin3、Plin4和Plin5[2]共5個成員。Plin1和Plin4在白色脂肪細胞和棕色脂肪細胞中表達[3-4]；Plin2和Plin3在動物體內普遍表達[5]；而Plin5在心臟、肝臟和脂肪等氧化修飾的組織中高度表達[6]。Plin3和Plin4均在脂滴初步合成中發揮作用[7]。目前已知脂肪組織中Plin4缺失沒有影響脂肪組織的脂代謝功能[8]。Plin3可快速促進新脂滴的合成，在胞質和脂滴表面之間具有轉運功能，并參與調節脂質代謝；使用siRNA敲除Plin3發現，甘油三酯水平降低，脂滴形成受到抑制[9]；據報道，Plin3分別參與了肥胖誘導的肝臟和骨骼肌中脂質代謝和胰島素敏感性的失調[10]，如Plin3在肌肉中過表達可增加肌肉細胞中甘油三酯的含量[11]，Plin3缺失可降低肌肉細胞中甘油三酯的含量，并抑制脂滴成熟[12]；以上研究表明Plin3在甘油三酯穩定儲存方面發揮了作用。在心肌細胞中，Plin2和Plin5位于脂滴表面；而在棕色脂肪組織的脂肪細胞中，Plin1和Plin5覆蓋在脂滴表面。盡管在上述脂滴均有Plin蛋白表達，但Plin5在調節脂解和脂滴合成中起主導作用。有研究表明，禁食可以誘導Plin5的表達，通過與過氧化物酶體增殖物激活受體α (peroxisome proliferator-activated receptorα，PPARα)相互作用調節脂質代謝；由Plin5缺陷小鼠模型可知，脂肪合成受到抑制，但加快了脂肪酸代謝和線粒體的增殖[13]。Plin5通過結合比較基因識別-58(comparative gene identification-58，CGI-58)抑制脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)活性，從而干擾ATGL介導的脂肪分解代謝的過程[14]。可見，Plin5在脂肪合成代謝中起到重要作用。另外，Laurens等[15]證明Plin5在脂肪分解過程中，可通過促進脂肪酸氧化來滿足代謝加快的需求。Plin5敲除小鼠經高脂飲食后，導致輕微的肝功能受損[16]，可見Plin5是肝臟穩態的多效性調節因子[15]。此外，研究顯示Plin5的缺失可干擾線粒體的功能，從而加劇肥胖小鼠心肌的氧化應激損傷，最終引起小鼠心臟功能的進一步損害[17]。相反，在小鼠心肌細胞中過表達Plin5會大量增加脂滴中三酰基甘油的儲存[18]。也有研究表明，Plin5可能調節激素敏感性脂肪酶活性，進而影響肌肉的生長發育[19]。由上可知，Plin3和Plin5在脂代謝調節中發揮直接作用。

河北科技師范學院豬種質資源挖掘課題組前期對長白豬轉錄組測序[20]鑒定出多個與脂質代謝相關的差異表達基因，如Plin3、Plin5、誘導細胞死亡的DFF45樣效應因子B基因(cell death-inducing DFF45-like effector B，CIDEB)和誘導細胞凋亡DFF45樣效應因子C基因(cell death-inducing DFF45-like effector C，CIDEC)等。進一步將Cidec轉染細胞分析脂滴形態，發現Plin3和Plin5在此過程中表達量差異明顯。此外，目前對于Plin3和Plin5在調控長白豬肌肉生長發育方面鮮有研究[21]。鑒于此，本試驗通過構建這2個基因表達載體并研究其在長白豬各個組織中的表達規律，探究其在調節脂肪代謝過程中的潛在作用，旨在為鑒定調控豬肌內脂肪細胞生成的關鍵調節因子提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗所用樣品來自河北省秦皇島市昌黎縣肉聯廠，選取營養條件相同體重相似的3頭6月齡雄性長白豬，3頭豬的平均胴體重為79 kg。屠宰采集其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、皮下脂肪、大腸、小腸、背長肌和膀胱11種組織，包裝編號，并迅速置于液氮中。

1.2 主要試劑

TrQuick Reagent、Methylidyne trichloride、異丙醇，河北科技師范學院動物實驗室；焦碳酸二乙酸、Goldenview，北京拜爾迪生物科技有限公司；2×Es Taq MasterMix，武漢莫納生物科技有限公司；反轉錄試劑盒、qPCR SYBR Green Master Mix，上海翊圣生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、DL2000 DNA Ladder，北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 載體和菌株

pcDNA3.1+載體由河北省秦皇島市昌黎縣河北科技師范學院動物實驗室保存，DH5α菌株購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 引物設計與合成 根據GenBank中收錄的豬的Plin3、Plin5基因序列，使用Primer 5.0軟件設計引物(表1)，并由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

表1 PCR引物序列信息Table 1 PCR primer sequence information

1.4.2 總RNA提取和cDNA合成 根據Trizol法[22]提取長白豬11個組織的總RNA，用NanoDrop2000超微量分光光度計(Bio-Rad，美國)檢測其RNA濃度和純度。參照反轉錄試劑盒說明書對11個組織的總RNA進行反轉錄。

1.4.3 基因擴增 以1.4.2得到的cDNA為模板進行普通PCR擴增，擴增反應體系為10 μL：H2O 3 μL、2×Taq MasterMix 5 μL、100 ng·μL-1cDNA 1 μL、10 μmol·L-1上游引物0.5 μL、10 μmol·L-1下游引物0.5 μL。擴增程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃再延伸5 min，20℃ 終延伸5 min，4℃條件下保存2 h備用。將產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用膠回收試劑盒回收PCR片段，隨后與PMD?18-T載體連接后轉化到DH5α感受態細胞，涂布到含Amp+的LB培養基上，并挑取單克隆菌株進行PCR鑒定，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4.4 實時熒光定量PCR檢測 根據SYBR Green熒光染料法[23]進行實時熒光定量PCR，反應總體系為20 μL。利用GAPDH為內參基因，按照2-△△Ct算法計算Plin3、Plin5基因在各個組織中的相對表達量。每組試驗重復3次，數據以平均值±標準差表示，并利用Graphpad Prim 8軟件將表達量進行單因素方差分析，不同小寫字母表示存在顯著差異(P<0.05)。

1.4.5 生物信息學分析 利用表2的生物信息學分析軟件[22-23]對長白豬的Plin3和Plin5進行分析。Plin3的物種類型分別為人(Homosapiens，登錄號：NP_001157661.1)、豬(Susscrofa，登錄號：NP_001026948.1)、家鼠(Musmusculus，登錄號：NP_080112.1)、斑馬魚(Daniorerio，登錄號：NP_001373243.1)、家犬(Canislupusfamiliaris，登錄號：XP_038284951.1)、家貓(Feliscatus，登錄號：XP_023106648.1)、山羊(Caprahircus，登錄號：NP_001272524.1)、大猩猩(Gorilla，登錄號：XP_018871611.1)、家牛(Bostaurus，登錄號：NP_001070514.1)、家馬(Equuscaballus，登錄號：XP_023500242.1)；Plin5的物種類型有人(Homosapiens，登錄號：NP_001013728.2)、豬(Susscrofa，登錄號：NP_001116607.1)、家鼠(Musmusculus，登錄號：NP_001070816.1)、家犬(Canislupusfamiliaris，登錄號：XP_038284970.1)、家貓(Feliscatus，登錄號：XP_011286089.1)、山羊(Caprahircus，登錄號：XP_017906367.1 )、大猩猩(Gorilla，登錄號：XP_030862323.1)、家牛(Bostaurus，登錄號：NP_001094606.1)、家馬(Equuscaballus，登錄號：XP_023500224.1)、鳉魚(Poeciliareticulata，登錄號：XP_008405304.1)。

表2 生物信息學軟件Table 2 Bioinformatics software

2 結果與分析

2.1 長白豬Plin3、Plin5基因克隆

利用表1設計的特異PCR引物進行PCR克隆，PCR擴增產物經電泳檢測后，Plin3基因在約1 400 bp有明亮的擴增條帶，Plin5基因在1 357 bp左右有明亮的擴增條帶。圖1說明PCR擴增產物為單一特異性條帶，片段大小與預測片段大小幾乎一致，可通過回收DNA片段進行載體轉化。

注：P3、P5分別表示Plin3、Plin5的PCR擴增產物；M表示2 000 bp DNA Ladder Marker。Note: P3 and P5 represent the PCR amplification products of Plin3 and Plin5, respectively. M stands for 2 000 bp DNA ladder marker.圖1 PCR擴增凝膠電泳檢測圖Fig.1 Detection of GEL electrophoresis by PCR amplification

2.2 生物信息學分析

2.2.1 與其他物種系統進化樹的構建 由圖2可知，長白豬Plin3、Plin5氨基酸序列與山羊和家牛的親緣關系近，Plin3與斑馬魚親緣關系遠；Plin5氨基酸序列與鳉魚的親緣關系遠。同時，將長白豬Plin3、Plin5與其他物種序列比對分析其同源性可知，Plin3與山羊的同源性最高(89.98%)，與斑馬魚的同源性最低(39.60%)；Plin5與山羊的同源性也最高(90.17%)，與鳉魚的同源性最低(26.94%)。此結果與進化樹的結果一致。

注：A為Plin3系統進化樹圖；B為Plin5系統進化樹圖。Note: A is the phylogenetic tree of Plin3 system. B is the phylogenetic tree of Plin5 system.圖2 豬Plin3、Plin5系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of pig Plin3 and Plin5

2.2.2 長白豬Plin3、Plin5蛋白質理化性質預測 經克隆得到的Plin3蛋白質分子式是C2067H3354N596O675S17，其分子量為47 899.98 Da，理論等電點為5.60，編碼439個氨基酸，編碼的氨基酸數量見表3，纈氨酸(V)個數為49，比例最高，為11.2%，不含吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸，消光系數是29 575，推測半衰期為30 h，不穩定指數46.22，為不穩定蛋白，脂肪系數為81.91，總平均親水性為-0.245。Plin5的蛋白質分子式為C2205H3532N654O670S19，其分子量為50 533.42 Da，理論等電點為5.50，編碼458個氨基酸，編碼氨基酸數量見表4，亮氨酸(L)個數為59，比例最高，為12.9%，不含吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸，消光系數是48 970，推測半衰期為30 h，不穩定指數57.69，為不穩定蛋白，脂肪系數為87.77，總平均親水性為-0.382。

表3 Plin3編碼的蛋白質氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of proteins encoded by Plin3

2.2.3 蛋白質二級結構和三級結構 經預測長白豬Plin3二級結構見圖3-A，其中無規則卷曲占21.13%、延伸鏈占3.19%、α-螺旋占74.03%、β-轉角占1.59%；Plin5二級結構見圖3-B，其中無規卷曲占26.64%、延伸鏈占2.84%、α-螺旋占68.12%、β-轉角占2.40%。Plin3蛋白質三級結構建模預測如圖3-C所示，全面模型評估值是0.41，序列相似性為0.52，模型構建符合要求，該三級結構顯示其存在多個α-螺旋結構；Plin5蛋白三級結構建模預測如圖3-D所示，全面模型評估值是0.38，序列相似性為0.40，模型構建符合要求，該三級結構顯示其存在多個α-螺旋結構。用STRING數據庫預測與Plin3相互作用的蛋白(圖3-E)，結果顯示，Plin3可能與M6PR、PNPLA2和ABHD5等蛋白存在相互作用。用STRING數據庫搜索與Plin5蛋白可能相互作用的蛋白(圖3-F)，結果顯示Plin5可能與ABHD5、PNPLA2和PNPLA3等蛋白存在相互作用。

表4 Plin5編碼的蛋白質氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of protein encoded by Plin5

注：A：Plin3蛋白質二級結構，h為α-螺旋，e為延伸鏈，t為β-轉角，c為無規則卷曲；B：Plin5蛋白質二級結構；C：Plin3蛋白質三級結構；D：Plin5蛋白質三級結構；E：Plin3相互作用蛋白預測；F：Plin5相互作用蛋白預測。Note: A: The secondary structure of Plin3 protein. h is α -helix. e is extended chain. t is β-turn angle. c is random crimp. B: The secondary structure of Plin5 protein. C: The tertiary structure of Plin3 protein. D: The tertiary structure of Plin5 protein. E: The prediction of Plin3 interacting protein. F:The predicted of Plin5 interacting protein. 圖3 長白豬Plin3、Plin5蛋白結構預測Fig.3 Protein structure prediction of Plin3 and Plin5 in landraces

2.2.4 蛋白質疏水性、信號肽及跨膜區分析 由圖4-A可知，Plin3整條氨基酸鏈在第423位氨基酸處有最大疏水值1.756，第268位氨基酸處有最小疏水值 -2.789， 總平均疏水性為-0.339，可以看出Plin3靠近N端前端表現出較強的親水區域(score>1)，中端靠近C端位置表現出較強的疏水性。由圖4-B可知，Plin5整條氨基酸鏈在383位點有最大疏水值1.967，在193位點有最小疏水值-3.133，總平均疏水性為-0.380，Plin5靠近N端位置表現出較強的疏水性，靠近C端位置存在較強的親水性。同時對Plin3、Plin5蛋白的信號肽及跨膜區域結構進行預測分析可知，兩個蛋白均無信號肽、無跨膜區域結構。

注：A：Plin3蛋白疏水性分析；B：Plin5蛋白疏水性分析。Note: A: The hydrophobicity analysis of Plin3 protein. B: The hydrophobicity analysis of Plin5 protein.圖4 長白豬Plin3、Plin5蛋白疏水性Fig.4 Hydrophobicity of Plin3 and Plin5 proteins in landraces

注：不同小寫字母表示不同組織之間差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant differences between tissues at 0.05 level.圖5 長白豬Plin3、Plin5基因在不同組織中的表達量Fig.5 Expression of Plin3 and Plin5 genes in different tissues of landraces

2.2.5 蛋白質磷酸化位點預測 預測結果顯示長白豬Plin3共有53個磷酸化位點，其中絲氨酸上有30個磷酸化位點，蘇氨酸上有21個磷酸化位點，酪氨酸上有2個磷酸化位點；Plin5共有25個磷酸化位點，絲氨酸上有18個磷酸化位點，蘇氨酸上有6個磷酸化位點，酪氨酸上有1個磷酸化位點。之后，對Plin3、Plin5進行糖基化位點預測，兩個蛋白均無N端糖基化位點；Plin3含有23個O端糖基化位點，Plin5含有10個O端糖基化位點。

2.3 長白豬Plin3、Plin5基因的組織表達譜

由圖5-A可知，Plin3在長白豬的各個組織中均有表達，在脾中的相對表達量顯著高于在其他10種組織中，其次是肝、膀胱、腎、小腸、肺、脂肪，在背長肌中的相對表達量最低。由圖5-B可知，Plin5在脂肪組織中的相對表達量顯著高于在其他組織，其次是腎、肝、背長肌、心、肺、脾、膀胱、胃，在大腸和小腸中幾乎不表達，且在腎臟中的相對表達量除了與肝中的相對表達量差異不顯著以外，與其他組織中的相對表達量均有顯著差異。

3 討論

本研究成功克隆了Plin3、Plin5基因全長序列，其中Plin3序列全長1 403 bp，編碼439個氨基酸，Plin5序列全長1 397 bp, 編碼458個氨基酸，與Genbank數據庫中豬的Plin3、Plin5序列一致。2個基因在多個物種中均有表達，其中在小鼠和山羊中Plin3均編碼437個氨基酸[24-25]；Plin5在人和鼠物種上編碼463個氨基酸[26]，在不同物種中2個基因編碼的氨基酸數量差異不大，證明2個基因的遺傳距離較近。對兩者氨基酸序列分析發現，Plin3和Plin5氨基酸序列與山羊和家牛的氨基酸序列同源性較高，進化樹分析顯示與山羊和家牛的親緣關系也較近，推測2個蛋白質的保守性較強，此結果與郝娟等[25]在西農薩能羊和焦迪等[26]在陸川豬中的研究結果一致。

動物體內脂肪沉積的形成主要受脂質代謝平衡的影響，脂滴在脂代謝平衡中起重要作用。PAT蛋白是覆蓋在脂滴表面的結構蛋白，包含兩親性螺旋結構[27]，這些結構特征使其與其他蛋白質能夠緊密結合。本研究預測Plin3、Plin5蛋白質結構發現，這兩種蛋白質二級結構主要由α-螺旋組成，與其三級結構預測結果一致。進一步預測發現這兩種蛋白質含有大量的疏水性殘基，可緊密結合在脂滴表面。本研究還發現兩種蛋白無信號肽、無跨膜結構和N端糖基化位點，但經預測其有多個磷酸化位點和O端糖基化位點。研究表明，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)可誘導Plin3的S31和T216位點磷酸化，促進脂滴分解[28]；兒茶酚胺可使Plin5的S140和S155位點磷酸化，增強脂肪分解[29]。同時，本研究預測Plin3和Plin5均與甘油三脂水解酶(patatin like phospholipase domain containing 2，PNPLA2)和含自水解酶域蛋白5(α/β-hydrolase domain containing 5，ABHD5)相互作用，Karczewska等[30]已證實PAT家族蛋白確與PNPLA2和 ABHD5相互作用。因此推測，Plin3和Plin5蛋白可通過蛋白互作形式調控脂質代謝，但在長白豬中如何發揮作用仍不清楚，因此本研究進一步分別探究了Plin3和Plin5基因在長白豬體內的表達情況。

本研究采用實時熒光定量PCR技術檢測Plin3和Plin5在長白豬11個組織中的表達情況，其中Plin3在肝臟和脾臟中的相對表達量較高，而郝娟等[25]發現西農薩能羊Plin3在乳腺中的表達量最高，但該基因在這2個物種肌肉組織中的表達量均較低，表明Plin3的表達具有物種特異性。Plin5在長白豬的脂肪組織中表達量最高，其次是腎臟、肝臟，而焦迪[31]研究發現Plin5在陸川豬和杜洛克豬的肝臟中表達量最高，表明Plin5在相同物種不同豬品種之間的表達有一定差異，且以上組織的耗氧量均較高，由此推測Plin5與能量代謝相關。在Plin5的功能研究中，王天宇[32]研究發現在小鼠體內過表達Plin5時，解偶聯蛋白1(uncoupling protein1，UCP1)含量增高，促進了白色脂肪棕色化，這表明Plin5參與調節脂肪組織的脂質代謝；在高脂飲食的小鼠模型中，Ma等[33]發現鈣調素(calmodulin，CaM)缺失抑制Plin5蛋白分解，從而阻礙了肝細胞脂肪分解，導致非酒精性脂肪肝形成；Anastasia等[34]發現在高脂飲食下，Plin5缺失的小鼠，抑制NLR家族含嘧啶結構域3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)的激活，導致輕微的肝臟損傷；Kuramoto等[35]研究發現Plin5在心臟中也有重要功能，通過保護脂滴減少線粒體中脂肪酸的氧化來抑制過量的活性氧產生。綜上，Plin3在大多數的組織中廣泛表達，在調控脂肪分解代謝和肝臟脂肪變性的過程中起到重要作用；Plin5主要在氧化組織中表達，在脂質的儲存方面起重要作用。綜合以上結果可知，這兩個蛋白質在脂代謝過程中發揮的特定作用取決于其所在的位置。但目前鮮見這兩種基因在長白豬生長發育中分子機制的相關報道。因此，本研究可為兩種基因在長白豬脂質代謝機制研究中提供一定的理論依據。

4 結論

本研究首次克隆了長白豬Plin3、Plin5基因的全長序列，其序列長度分別為1 403、1 397 bp。兩個蛋白質的二級結構均以α-螺旋為主，且蛋白保守性強。Plin3在長白豬的脾臟和肝臟中相對表達量顯著高于其他組織中的相對表達量，肌肉中相對表達量最低；Plin5在長白豬脂肪組織中的相對表達量最高，在大腸和小腸內不表達，肝臟組織和脂肪組織是對能量代謝活躍的器官。因此推測，Plin3、Plin5基因在脂質能量代謝方面發揮作用。