富含魚油飲食對輕型顱腦爆炸沖擊傷大鼠的神經保護作用研究

張雯倩, 王 濤, 王 佳, 王培新, 顧建文, 趙全軍

作者單位：1安徽醫科大學解放軍306臨床學院，安徽醫科大學第五臨床醫學院，北京 1001012戰略支援部隊特色醫學中心神經外科，北京 1001013商洛市中心醫院神經內科，陜西 726000

爆炸沖擊波導致的顱腦損傷是軍隊作戰最常見的損傷之一，而其中很大一部分比例屬于輕型顱腦損傷[1]，該損傷經常導致記憶與認知功能障礙、情緒障礙等神經功能障礙[2]，因此，研究顱腦爆震沖擊傷是現代軍事醫學的重要熱點和研究方向。過去幾十年，魚油已被普遍證實其對于神經系統有改善作用，促進腦細胞神經元的發育，尤其在一些神經退行性病變和精神疾病模型中顯示出一定的保護作用。該研究將尋找神經保護因素聚焦于“魚油”，以一種全新的密閉氣壓引爆裝置來建立顱腦爆炸沖擊傷模型，探索其對于輕型顱腦爆炸沖擊傷模型的神經保護作用，為將魚油作為“神經保護因素”加入部隊飲食提供實驗理論依據，為提高我軍部隊服役人員戰斗力提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物54只SD雄性乳鼠(斯貝福, 北京)，體質量62～74 g，置于恒溫飼養房內(溫度25 ℃，濕度約50%)。所有大鼠隨機均分為3組：對照組、模型組、治療組。其中對照組與模型組的大鼠給予普通維持飼料進行喂養，治療組大鼠給予富含魚油飼料進行喂養[3]。飼養33 d后，模型組及治療組建立由沖擊波誘導的輕型顱腦爆炸沖擊損傷模型，對照組大鼠不接受爆炸沖擊波損傷處理。損傷后，分別選取6 h、24 h、3 d三個時間點對各組大鼠進行處死，每次處死6只。

1.2 建立輕型顱腦爆炸沖擊傷模型

1.2.1爆炸裝置簡介 該模型的基本原理是利用密閉氣壓引爆裝置產生沖擊波對大鼠造成顱腦爆炸沖擊傷，其設計完全模擬野戰環境。此裝置由高壓氮氣瓶、壓力表、儲氣罐、雙法蘭結構、十字槽鋁片和實驗動物固定器組成。當高壓氮氣瓶里的壓力達到十字槽鋁片的閾值時，沖擊波會沖破十字槽鋁片，對動物固定器里的大鼠造成爆炸沖擊傷。動物固定器是一個由鋼板制成的保護艙，有一個直徑為2 cm的圓孔與外界相通，大鼠被固定于保護艙后，僅頭部從圓孔暴露，胸部、腹部、四肢等其他部位皆被保護艙保護起來。見圖1。

圖1 密閉氣壓引爆裝置實物圖

1.2.2模型制備 大鼠用1.5%戊巴比妥鈉1 ml腹腔注射麻醉，麻醉成功后將大鼠固定于保護艙內，用一個U形的鐵支架固定其頭部，保證大鼠在爆炸過程中盡量減少頭部運動。通過調節裝置與固定器之間的距離、十字槽鋁片的刻度來控制爆破強度。按照之前的實驗方法，最后選擇爆炸距離50 cm，鋁片刻度0.6 mm標準參數用以模擬輕型顱腦爆炸損傷，測量沖擊波峰壓(71.16±1.65)kPa，與文獻[4]報道輕型顱腦損傷程度一致。

1.3 檢測方法及指標

1.3.1腦組織切片制備 各組分別于6 h、24 h、3 d三個時間點各隨機抽取6只大鼠深度麻醉，用4%多聚甲醛(PFA)經左心室灌注大腦，并完整取出，按4% PFA、10%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液的順序浸泡脫水。將選定范圍內腦組織冰凍后行45 μm層厚連續冠狀切片，貼于已處理的載玻片上供后續實驗使用。

1.3.2病理觀察和免疫組化染色 腦組織切片依次經過蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察各組腦組織結構的病理學變化。另外，腦組織切片用0.1 mmol/L PBS緩沖液(pH7.4)洗滌3次，在含5%山羊血清和0.3% Triton X-100的PBS液中封閉孵育1 h (37 ℃)后，分別用GFAP單抗(鼠源, 1 ∶2 000, Vector lab, 美國)和Iba-1單抗(鼠源, 1 ∶1 500, Vector lab, 美國)室溫孵育24 h，再經過羊抗鼠IgG和交聯可吸收的橙/紅二抗( Vector lab)室溫孵育2 h。顯微鏡下觀察抗原抗體的染色情況并拍照。陰性對照染色用0.1 mmol/L PBS代替上述抗體。

1.3.3損傷神經元染色 用Fluoro-Jade B組織熒光染色法檢測大鼠腦組織神經元損傷情況。腦組織切片依次置于100%、75%、50%乙醇及超凈水中序貫復水，接著于0.006%高錳酸鉀溶液中輕微震蕩搖晃15 min并以超凈水清洗，接下來將切片置于0.001% FJ-B(Histochem, 美國)和0.1%醋酸染色液中染色(30 min, 避光)。最后在二甲苯中浸泡10 min后蓋片備用。

1.3.4細胞定量計數 對大鼠海馬CA1區錐體細胞計數采用的是人工計數的方法，每張切片相應區域選取3個視野，測量每個視野中錐體細胞條帶長度，通過人工計數細胞膜、核膜完整，核仁清楚的存活錐體細胞，換算成錐體細胞數(個/mm2)。細胞定量采用的是Image-Pro Plus 6.0分析軟件，分別選擇海馬CA3區(一端以上下末端顆粒細胞進入齒狀突為界，另一端以錐體細胞層變窄交界區即CA1/2交界區域為界)以及暴露損傷周邊皮層為計數區域，測量每張圖片中相應區域的GFAP、Iba-1和FJ- B陽性細胞數。

2 結果

2.1 大鼠爆炸傷前后體質量變化情況大鼠初始體質量無差別，分別是(69.28±2.78)、(68.75±2.79)、(68.63±4.13)g。傷前共進食33 d，三組大鼠體質量增長變化差異無統計學意義(F=0.015)。至外傷當天，三組大鼠實際體質量無明顯差別，分別是(312.26±6.25)、(312.33±7.55)、(315.39±8.50)g。傷后第一天和第二天，模型組及治療組大鼠體重較對照組均出現了一定程度體質量下降，從第三天開始體質量逐漸上升，兩組大鼠傷后體質量下降程度及恢復至傷前體重水平所需時間差異無統計學意義(F=1.212)。見圖2。

圖2 大鼠爆炸傷前后體質量變化情況

2.2 大鼠爆炸傷后腦組織CA1區錐體細胞變化情況所有輕型爆炸傷后腦組織大體病理學均顯示腦組織皮層結構完整，無明顯挫裂傷及血腫表現。本實驗腦組織神經細胞觀察區域限定為雙側腦組織海馬CA1區，光鏡下各組大鼠海馬CA1區錐體細胞形態規則，細胞排列整齊，胞仁胞質清晰，模型組大鼠海馬錐體細胞層皺縮較明顯，神經細胞大體分布較為稀疏。見圖3。通過立體細胞計數測量系統分析結果提示，輕型爆炸傷后6 h、24 h、3 d，模型組和治療組大鼠海馬觀察區域的錐體細胞數量均較對照組明顯減少(F=229.506，P<0.01)；與模型組相比，治療組可明顯增加傷后海馬區錐體細胞數量(P<0.01)。不同組別各時間點間差異無統計學意義(F=1.528)。見表1。

表1 各組大鼠海馬CA1區單位面積錐體細胞數(個，

2.3 大鼠爆炸傷后腦組織星形膠質細胞變化情況所有對照組大鼠腦組織海馬區均未發現星形膠質細胞數量形態改變，見圖4。輕型顱腦爆炸沖擊傷后6 h、24 h、3 d，模型組及治療組免疫熒光染色均顯示海馬區GFAP陽性細胞減少，與對照組相比差異有統計學意義(F=396.625，P<0.01)，見表2。同時在光鏡下觀察損傷海馬區域反應性增生的星形膠質細胞，形態上表現為胞體肥大，細胞突起模糊不清。與模型組相比，治療組可明顯增加傷后GFAP陽性星形膠質細胞數量(P<0.01)，不同組別各時間點間差異無統計學意義(F=2.585)。見表2。

圖3 大鼠輕型顱腦爆炸沖擊傷后6 h海馬區 HE ×100、×200

表2 各組大鼠海馬區GFAP細胞陽性數(個，

2.4 大鼠爆炸傷后腦組織小膠質細胞變化情況Iba-1染色分析結果顯示，輕型顱腦爆炸沖擊傷后6 h、24 h、3 d模型組及治療組大鼠腦組織海馬區激活態小膠質細胞均較對照組有明顯增加(F=356.962，P<0.01)，且模型組多于治療組(P<0.01)，見圖5。對照組大鼠6 h、24 h、3 d三個時間點海馬區Iba-1陽性細胞計數統計差異均無統計學意義，模型組及治療組大鼠差異有統計學意義(F=95.263，P<0.01)，隨著時間延長，激活態小膠質細胞逐漸增多，見表3。

2.5 大鼠爆炸傷后腦組織皮層神經元凋亡情況對輕型顱腦爆炸沖擊傷后腦組織皮層神經元FJ-B染色分析顯示，對照組大鼠各時間點均無明顯陽性染色，模型組及治療組大鼠中，爆炸傷后各時間點損傷神經元均明顯多于對照組(F=821.864，P<0.01)，且模型組多于治療組(P<0.01)。同時，模型組及治療組各時間點損傷神經元仍呈逐漸增多趨勢，3 d多于24 h多于6 h，各時間點差異均有統計學意義(F=812.135，P<0.01)，見表4、圖6。

表3 各組大鼠海馬區Iba-1細胞陽性數(個，

表4 各組大鼠海馬區FJ-B細胞陽性數(個，

圖4 大鼠輕型顱腦爆炸沖擊傷后6 h海馬區 GFAP×200

圖5 大鼠輕型顱腦爆炸沖擊傷后3 h, 24 h, 3 d海馬區 Iba-1 ×200

圖6 大鼠輕型顱腦爆炸沖擊傷后6 h, 24 h, 3 d腦組織皮層 FJ-B ×200

3 討論

近年來，隨著局部地區高科技水平戰爭的爆發，爆炸性武器成為戰爭中的主要殺傷性武器，士兵們深受其害，而頭部在爆炸致傷的部位中占據比例尤其高。由于作戰時士兵們有防彈衣和防彈頭盔的保護，因此，士兵們的頭部爆炸傷大部分屬于輕型顱腦爆炸沖擊傷。

早在第一次世界大戰期間，就出現了所謂的“彈震癥”或“炮彈休克”的概念，即為輕型的爆炸相關性顱腦損傷。后來，隨著前輩們對輕型顱腦爆炸沖擊傷的深入研究，顱腦爆炸傷動物模型也應運而生。基于前輩們對顱腦爆炸傷模型的研究，課題組發明了一種全新的密閉氣壓引爆裝置來建立顱腦爆炸沖擊傷模型，該裝置已獲得專利，且試用穩定性好，完全模擬野戰環境，高度還原作戰時士兵所處環境，本實驗創新性地使用此裝置來探究魚油對輕型顱腦爆炸沖擊傷大鼠的神經保護作用。

魚油是一種從多脂魚類中提取的油脂，富含二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)多種n-3系多不飽和脂肪酸(n-3PUFA)，其對神經系統的保護作用得到大家的共同認可。本課題組成員探討過進食富含w-3多不飽和脂肪酸飲食對反復輕型顱腦損傷模型大鼠的神經保護作用[3]，本實驗則聚焦于魚油對輕型顱腦爆炸傷后大鼠的神經保護作用，顯示魚油可以減少海馬及皮層腦組織的神經元凋亡，同時削弱輕型顱腦爆炸沖擊傷對星形膠質細胞帶來的破壞，減弱了爆炸傷后大鼠腦組織的炎癥反應。

眾所周知，星形膠質細胞在維持腦組織生理外環境的平衡、神經元營養、神經遞質傳遞、毒性物質的清除等過程中發揮著重要作用[5-6]，輕型顱腦爆炸沖擊傷后星形膠質細胞損傷，數目缺失、胞體突起腫脹，無疑會引起神經元的二次損害及神經功能障礙。研究[7]顯示，富含魚油飲食的小鼠的星形膠質細胞要更加活躍，證明w-3多不飽和脂肪酸飲食對星形膠質細胞具有激活作用，保證在外傷來臨之前星形膠質細胞處于一種“備戰”狀態，從而減弱腦組織受損傷的程度。本實驗顯示，無論是6 h、24 h、還是3 d，治療組大鼠腦組織海馬區GFAP陽性染色細胞數均多于模型組，這說明魚油在一定程度上保護了星形膠質細胞免受破壞。

小膠質細胞隸屬于單核-巨噬細胞系統，在外傷、感染等病理因素聚集下成為腦組織抵御損傷的第一道防線[8]。本研究顯示大鼠爆炸傷后6 h腦組織海馬區小膠質細胞即出現了活化，數量明顯多于對照組。且隨著時間的延續，小膠質細胞不斷活化，形態上表現為突觸收縮，胞體增大融合，形成巨噬樣改變，吞噬有害物質，數目越來越多，炎癥反應越來越明顯。魚油是一種抗炎化合物[9]，可以增強小膠質細胞屏障[10]，提高小膠質細胞吞噬能力，具有神經保護作用。本實驗結果顯示，治療組在各個時刻小膠質細胞數目均明顯少于模型組，這表明魚油減弱了爆炸傷后大鼠腦組織內的炎癥反應，增強了小膠質細胞的屏障功能及抵御外來傷害的能力。

綜上，輕型顱腦爆炸沖擊傷對大鼠腦組織有損害作用，包括星形膠質細胞的損傷、炎癥的產生、神經元的凋亡等，而魚油對大鼠的腦組織有一定的保護作用，可減弱這些損傷的發生及程度。