慢性子代應激改善妊娠期慢性應激誘導的子代雄鼠抑郁

陶 龍，劉 銳，徐家雯，張 闊，姚余有

作者單位:安徽醫科大學公共衛生學院1衛生檢驗與檢疫學系、2人口健康與優生安徽省重點實驗室，合肥 230032

抑郁癥作為一種全球性的精神疾病，其特點是消極和動機減少，嚴重危害人們的身心健康[1]，是全球總體疾病負擔的主要原因[2]。目前，抑郁癥的發病機制尚未闡明，有研究[3]顯示暴露于慢性應激事件可以增加人類患抑郁癥的風險。同時，動物研究[4-5]發現，孕鼠在懷孕期間遭受慢性應激會誘導其后代出現抑郁樣行為, 且雄性子代更易出現。當今社會競爭激烈，孕婦和其子代都有可能暴露于慢性應激環境中，但很少有研究關注慢性子代應激對妊娠期慢性應激的子代抑郁有何影響。因此，該文擬通過觀察妊娠期慢性應激和慢性子代應激聯合作用對子鼠抑郁樣行為的影響，研究慢性子代應激對妊娠期慢性應激的子代抑郁有何作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物60只7周齡C57/BL6J小鼠(40只雌性、20只雄性)購自江蘇集萃藥康生物科技公司，體質量17～20 g。在標準實驗室條件下[室溫(24±1)℃, 濕度50%±2%, 光照12 h循環，無病原體環境]飼養。開始實驗前適應性喂養7 d，自由獲取水和食物。

1.2 試劑與儀器

1.2.1主要儀器 垂直電泳儀、轉移槽、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司);ELX全自動酶標儀(美國BD公司)；Centrifuge5424R冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；正置熒光顯微鏡(德國萊卡儀器有限公司)；SuperMaze系列行為學實驗系統(上海欣軟公司)。

1.2.2主要試劑 TUNEL試劑盒(上海羅氏制藥有限公司)； mTOR單克隆抗體(美國Abmart公司)；p-mTOR(Ser24448)單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；山羊抗兔IgG抗體和DBA顯色液(北京中杉金橋生物技術有限公司)； BCA測定試劑盒(上海碧云天公司)。

1.3 動物模型建立方案及分組C57/BL6J小鼠以雌雄2 ∶1的比例在19 ∶00進行合籠，第二天07 ∶00查陰栓，查到陰栓后將其進行單籠飼養，為懷孕第一天。正常飼養1周后，隨機選取20只孕鼠進行妊娠期慢性應激(chronic stress during pregnancy，CSDP)。應激方式包括：① 禁水24 h; ② 禁食24 h; ③ 束縛 2 h; ④溫水游泳15 min; ⑤ 冰水游泳5 min; ⑥ 夾尾5 min; ⑦ 晝夜顛倒12 h。自孕第7天開始，采用隨機數表法每天進行一種應激，直至孕鼠分娩。子鼠出生后于第21天被隨機分為母代正常對照+子代正常對照組(NC+NC)；母代正常對照+子代慢性應激組(NC+COS)；母代妊娠期慢性應激+子代正常對照組(CSDP+NC)；母代妊娠期慢性應激+子代慢性應激組(CSDP+COS)，每組8只。子代應激方式同孕鼠應激方式，在出生第21天至35天進行14 d的慢性應激。

1.4 行為學實驗

1.4.1高架十字迷宮實驗(elevated plus maze, EPM) 實驗時，將每組的8只小鼠單獨置于離地面50 cm高度的迷宮中，在迷宮上方固定攝像機，記錄小鼠運動情況。在測試前，用75%酒精溶液清洗迷宮，以避免嗅覺提示。每只小鼠被放置在迷宮的中央，面對著其中一只閉合的臂。每只動物探索時間為5 min。

1.4.2強迫游泳實驗(forced swimming test, FST) 在實驗開始前，將每組的8只小鼠單獨置于直徑20 cm的透明桶中游泳15 min(深度12 cm,水溫23～25 ℃)。第二天，將小鼠單獨放置在桶中進行游泳6 min,統計最后4 min不動時間總和。

1.5 TUNEL檢測海馬CA3區神經元凋亡用石蠟對腦組織進行包埋，在相應位置進行切片，經二甲苯脫蠟乙醇水化后，PBS清洗3次，滴加0.1%T-ritonX-100,0.1%檸檬酸鈉室溫消化8 min，PBS清洗3次后滴加TUNEL反應混合物，37 ℃、60 min，PBS清洗后滴加DAPI染液復染10 min，在熒光顯微鏡下(× 200)觀察。統計TUNEL陽性細胞數與細胞總數，陽性細胞數/細胞總數即為凋亡指數。

1.6 Golgi-Cox染色觀察海馬神經元樹突變化將小鼠大腦置于高爾基染色中浸泡7 d后，將其置于30%蔗糖溶液中浸泡3 d，使用震動切片機對其進行冠狀切片(200 μm)。切片分別在水(1 min)、氫氧化銨(30 min)、水(1 min)、顯影液(30 min)、水(1 min)連續染色。然后將切片在(50%、75%、95%和100%)酒精中連續脫水，二甲苯清洗后，中性樹脂封片，在顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 慢性子代應激對CSDP的子代雄鼠行為學影響高架十字迷宮實驗結果如圖1所示。與NC+NC組相比，CSDP+NC組開臂進入次數百分比降低(F(3,8)=24.689,P<0.05)，CSDP+COS組開臂進入次數百分比提高(F(3,8)=24.689,P<0.001)，NC+COS組開臂進入次數百分比差異無統計學意義；與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組和NC+COS組開臂進入次數百分比均上升(F(3,8)=24.689,P<0.001)。此外，與NC+COS組相比，CSDP+COS組開臂進入次數百分比也上升(F(3,8)=24.689,P<0.01)。強迫游泳結果顯示，與NC+NC組相比，CSDP+NC組強迫游泳不動時間提升(F(3,28)=3.631,P<0.01)；與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組強迫游泳不動時間降低(F(3,28)=3.631,P<0.01)。此外，與NC+COS組相比，CSDP+NC組和CSDP+COS組強迫游泳不動時間差異均無統計學意義；與NC+NC組相比，NC+COS組和CSDP+COS組強迫游泳不動時間差異亦無統計學意義。見圖2。

圖1 各組雄性子代小鼠開臂進入次數百分比

圖2 各組雄性子代小鼠強迫游泳不動時間

2.2 慢性子代應激對CSDP的子代雄鼠海馬神經元的影響在正置光學顯微鏡(×200)下觀察Golgi-Cox染色的小鼠腦切片，選取小鼠海馬CA3區進行拍照(圖3A)。使用sholl分析海馬神經元樹突進行分析(圖3B)。與NC+NC組相比，CSDP+NC組在30～90 μm同心圓上的樹突交點數量減少(30 μm:F(3,16)=54.00,P<0.01; 40 μm:F(3,16)=118.73,P<0.001; 50 μm:F(3,16)=106.05,P<0.001; 60 μm:F(3,16)=103.12,P<0.001; 70 μm:F(3,16)=59.27,P<0.01; 80 μm:F(3,16)=40.20,P<0.05; 90 μm:F(3,16)=25.78,P<0.05)，CSDP+COS組僅在40 μm和90 μm同心圓處存在差異(40 μm:F(3,16)=118.733,P<0.05; 90 μm:F(3,16)=25.783,P<0.05)。與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組樹突交點數量在30～70 μm間增加(30 μm:F(3,16)=54,P<0.05; 40 μm:F(3,16)=118.733,P<0.01; 50 μm:F(3,16)=106.05,P<0.05; 60 μm:F(3,16)=103.117,P<0.05; 70 μm:F(3,16)=59.267,P<0.05)。NC+COS組和CSDP+NC組相比，NC+COS組在40～90 μm同心圓內的樹突交點數量增加(40 μm:F(3,16)=118.733,P<0.01; 50 μm:F(3,16)=106.05,P<0.01; 60 μm:F(3,16)=103.117,P<0.01; 70 μm:F(3,16)=59.267,P<0.01; 80 μm:F(3,16)=40.2,P<0.05; 90 μm:F(3,16)=25.783,P<0.05)。見圖4。

在正置熒光顯微鏡(×200)下使用不同熒光波長觀察TUNEL處理海馬CA3區腦組織切片，DAPI染色的細胞核呈藍色，TUNEL染色的細胞核呈綠色，凋亡指數=TUNEL陽性細胞數/總細胞數。如圖5所示，與NC+NC組相比，CSDP+NC組凋亡指數增大(F(3,8)=117.514,P<0.001); 與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組細胞凋亡指數降低(F(3,8)=117.514,P<0.001)。此外，NC+COS組凋亡指數明顯低于CSDP+NC組，差異有統計學意義(F(3,8)=117.514,P<0.001)；NC+NC組、NC+COS組與CSDP+NC組3組之間細胞凋亡指數差異均無統計學意義(F(3,8)=117.514)。見圖6。

圖3 Sholl分析中各組具有代表性的神經元樹突追蹤

圖4 各組海馬神經元sholl分析的結果

圖5 TUNEL染色法檢測海馬CA3區神經元凋亡圖×200

圖6 各組TUNEL染色法凋亡指數

2.3 慢性子代應激對CSDP的子代海馬mTOR活性的影響采用Western blot方法檢測小鼠海馬中mTOR和p-mTOR蛋白含量，使用p-mTOR/m-TO來表示mTOR蛋白活性，結果如圖7所示。與NC+NC組相比，CSDP+NC組子代小鼠海馬mTOR活性降低(F(3,8)=28.762,P<0.01), CSDP+COS組海馬mTOR活性增加(F(3,8)=28.762,P<0.01), NC+COS組海馬mTOR活性呈下降趨勢(F(3,8)=28.762,P<0.05)；與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組海馬mTOR活性增加極為明顯(F(3,8)=28.762,P<0.001)。此外，NC+COS組與CSDP+NC組差異無統計學意義(F(3,8)=28.762,P>0.05)；NC+COS組相比于CSDP+COS組，其mTOR活性較低(F(3,8)=28.762,P<0.001)。

圖7 各組小鼠海馬mTOR蛋白活性

3 討論

越來越多的研究[6-7]表明抑郁癥與海馬損傷息息相關。很多研究關注于CSDP對誘發子代抑郁的影響。關于CSDP和慢性子代應激在雄性子代抑郁中有何種交互作用的研究很少。因此，本文旨在探討CSDP和慢性子代應激在誘導雄性子代抑郁中的相互作用及其機制。

該研究采用了慢性不可預測應激進行應激實驗，避免孕鼠對應激產生適應性。有研究[8]已證實鼠在妊娠期接受慢性不可預測應激后可表現出抑郁樣行為。FST和EPM已被廣泛應用于測量抑郁樣行為[9]。在FST實驗中，不動時間越長，表明小鼠抑郁程度越嚴重；在EPM實驗中，開臂進入次數百分比越低，代表小鼠抑郁程度越嚴重。本研究結果顯示，與NC+NC組相比，CSDP+NC組雄性子代小鼠在FST中不動時間延長、在EPM中開臂進入次數百分比明顯降低，表明抑郁樣行為增加，求生欲望較低；與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組開臂進入次數百分比明顯升高，強迫游泳不動時間降低。這些結果表明，CSDP誘導子代雄鼠呈現抑郁樣行為，慢性子代應激可以抑制妊娠期慢性應激誘導產生的雄性子代小鼠的抑郁樣行為，這與Van Den Hove et al[10]課題組在CSDP所產成年子代大鼠身上進行實驗所得到的的結果具有相似性。本研究結果，慢性應激對子鼠抑郁樣行為無明顯影響，這可能與子鼠月齡較小且應激時間較短有關。

以往的研究[11-12]表明海馬CA3區與抑郁樣行為存在著密切聯系。本研究選取海馬CA3區進行高爾基染色，結果顯示，與NC+NC組相比，CSDP+NC組在30～90 μm同心圓處樹突交點數量減少，CSDP+COS組僅在40 μm與90 μm同心圓處樹突交點數量有差異；與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組在30～70 μm同心圓處樹突交點數量明顯增加。上述結果表明，CSDP引起了海馬CA3區神經元樹突分支復雜性降低，慢性子代應激逆轉了CSDP所引起的海馬神經元樹突損傷。為了進一步驗證慢性子代應激是否能夠改善CSDP引起的海馬神經元損傷，課題組采用TUNEL染色法觀察細胞凋亡，結果顯示，與NC+NC組相比，CSDP+NC組海馬CA3區凋亡指數明顯升高；與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組海馬CA3區細胞凋亡指數明顯降低，這些結果進一步證實了CSDP誘導雄性子代小鼠海馬神經元損傷，慢性子代應激減輕了CSDP引起的神經元損傷。

mTOR信號通路參與調節神經元興奮、神經元分化和突觸的部分功能[13]。最近的研究[14]也表明mTOR可能介導了抑郁癥的發生。本研究顯示，與NC+NC組相比，CSDP+NC組mTOR活性明顯降低； 與CSDP+NC組相比，CSDP+COS組mTOR活性上升； CSDP+COS組相較于NC+NC組，其mTOR活性更高，提示慢性子代應激可能通過mTOR信號通路改善CSDP引起的抑郁樣行為和海馬病理損傷。

總之，CSDP誘導雄性子代小鼠出現抑郁樣行為，并伴有海馬神經元損傷和mTOR活性降低。慢性子代應激可以改善雄性子代小鼠的抑郁行為和海馬的病理損傷。CSDP和慢性子代應激在誘導雄性子代小鼠抑郁樣行為中具有拮抗作用，mTOR信號通路在其中發揮可能著重要作用，但更進一步的機制，有待深入研究。