iPSC-MSCs體外對骨關節炎患者關節軟骨組織的基質保護作用

袁曉陽，程 剛，吳玉嬌，張 峰，徐 靚，魏 偉，嚴尚學

作者單位：安徽醫科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽省協同創新中心，合肥 230032

骨關節炎(osteoarthritis, OA)是一種最常見的關節疾病，關節軟骨進行性退化和喪失，伴隨整個關節的結構和功能改變，包括滑膜、半月板(在膝部)、關節周圍韌帶和軟骨下骨[1]等，臨床表現為緩慢發展的關節疼痛、壓痛、僵硬、關節腫脹、活動受限和關節畸形等。現有臨床治療藥物如非甾體抗炎藥、注射用玻璃酸鈉、度洛西汀等，只能減輕局部腫脹、疼痛等癥狀，不能有效改善關節軟骨損傷，針對OA的治療仍然以對癥治療或施行關節置換手術為主[2]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)治療OA的臨床試驗研究中，大多數試驗處于Ⅰ/Ⅱ期安全性和有效性研究階段[3]。因此，MSCs 用于治療OA的安全性、有效性及其作用機制仍有待探索。

誘導多能干細胞是由成體細胞經轉錄因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)導入重編程而來的細胞，不但具備自我更新和多向分化潛能，還克服了胚胎干細胞存在的倫理和免疫原性等問題。課題組前期研究[4]顯示，誘導多能干細胞來源的間充質干細胞(iPSC-MSC)可改善OA大鼠關節病理，具有軟骨保護作用。為進一步研究iPSC-MSC對軟骨組織的作用及其機制，該研究以膝關節OA手術患者的軟骨組織樣本為對象，觀察iPSC-MSCs體外對炎癥因子釋放、軟骨基質保護的作用，探討iPSC-MSCs防治關節軟骨退變的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣本來源 經患者知情同意，收集安徽醫科大學第一附屬醫院收治的膝骨關節炎(knee osteoarthritis, KOA)人工關節置換手術的關節軟骨組織。OA患者納入標準：①符合中華醫學會骨科學分會制定的《骨關節炎診治指南(2007年版)》診斷標準；②保守治療無效需接受膝關節置換術；③意識清楚，簽署知情同意書。OA患者排除標準：①近1個月內使用關節腔注射患者；②合并嚴重心腦血管疾病、肝腎功能不全或免疫系統疾病者；③有膝關節化膿性感染、手術史者。

1.1.2細胞與試劑 iPSC-MSCs(批號：202104001)由安徽中盛溯源生物科技有限公司提供, 實驗前均經表型鑒定、計數和活力檢查。白細胞介素(interleukin，IL)-1β(SRP3083)購自美國Sigma公司；Human IL-6 ELISA試劑盒(Cat：#m1058097-J)、Human IL-10 ELISA 試劑盒(Cat：#m1064299-J)、Human MMP-13 ELISA試劑盒(Cat：#m1026259-J)為上海酶聯生物科技有限公司產品； Rabbit Anti-CollagenⅠ(abs120555)、Mouse anti-Collagen Ⅱ(NB600-844)購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1樣本處理 無菌環境下將KOA手術病人捐獻的關節軟骨組織剪成直徑約6 mm，厚1 mm的組織塊，置于含10%胎牛血清DMEM培養液的24孔板中，37℃、5%CO2培養48 h。

1.2.2分組及給藥 將處理好的軟骨組織塊作為實驗對象，分為對照組、IL-1β誘導組、iPSC-MSCs(1×105、1×106、1×107)細胞共培養組。除對照組外，各組加入IL-1β(終濃度10 ng/ml)培養96 h，再向iPSC-MSCs各組加入相應數量細胞，對照組和IL-1β誘導組加入等體積細胞培養液，每組設3個復孔，37 ℃、5% CO2繼續培養72 h，培養完成后，分別收集軟骨組織塊和培養上清液，培養上清液置于-80 ℃冰箱待測；軟骨組織塊一半用于糖胺聚糖(glycosaminoglycans，GAG)檢測，另一半置10%福爾馬林固定，用于病理組織學檢查。

1.2.3ELISA法檢測軟骨組織體外培養上清液MMP-13、IL-6、IL-10水平 將培養上清液解凍后，3 000 r/min離心20 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作檢測各因子水平。

1.2.4病理學檢測 取經10%福爾馬林室溫固定的軟骨組織，脫鈣后，石蠟縱向包埋、切片后進行HE染色，鏡下觀察組織病理學改變。

1.2.5免疫組織化學方法檢測Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原在軟骨組織樣本中的表達水平 樣本經處理后，脫鈣包埋切片，分別用乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復液和3%過氧化氫進行抗原修復并阻斷內源性過氧化物的干擾，一抗4 ℃孵育過夜，第二天室溫復溫后磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后，加二抗室溫孵育20 min，經染色封片后在顯微鏡下觀察。

1.2.6軟骨組織糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)水平檢測 采用DMMB(1,9-二甲基二亞基藍)法。取另一半組織培養塊后立即測定其濕重。60 ℃干燥3 d后測定其干重。將樣本放入1 ml PBS緩沖液中浸泡過夜。加入10 μl番木瓜酶液，60 ℃孵育6 h。在96孔培養板中加入10 μl標準品及10 μl樣本溶液，再加入20 μl DMMB溶液。1 min后，以PBS作為空白對照調零，用酶標儀(Infinite M1000 Pro全波長多功能酶標儀，瑞士Tecan公司)在690 nm處測定各樣品孔的吸光度(A)，從硫酸軟骨素標準曲線上查出待測樣品的濃度，結果以硫酸軟骨素(μg/mg)軟骨干重表示。

2 結果

2.1 iPSC-MSCs體外對OA患者關節軟骨組織病理的影響顯微鏡下檢查可見，對照組軟骨組織無異常分化細胞，軟骨細胞分布較均勻，大小和形態一致；IL-1β誘導組軟骨組織出現大量軟骨細胞腫脹形變、核皺縮、破裂死亡，伴有炎性細胞浸潤；iPSC-MSCs(1×106、1×107)細胞共培養可抑制IL-1β誘導的軟骨組織細胞病變(圖1)。

2.2 iPSC-MSCs體外對OA患者關節軟骨組織Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原表達的影響免疫組化法檢測軟骨組織中Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原表達水平，結果顯示，IL-1β可誘導軟骨組織Ⅰ型膠原水平表達升高，iPSC-MSCs(1×106、1×107)細胞與軟骨組織共培養，可降低IL-1β誘導的Ⅰ型膠原表達水平(圖2)。同時，IL-1β可降低軟骨組織中Ⅱ型膠原含量，iPSC-MSCs(1×106、1×107)與軟骨組織共培養，可升高軟骨組織中Ⅱ型膠原表達水平(圖3)。

2.3 iPSC-MSCs體外對OA患者關節軟骨組織GAG水平的影響表1結果顯示，與對照組比較，IL-1β誘導組軟骨組織GAG含量降低(P<0.05)，iPSC-MSCs(1×105、1×106、1×107)細胞體外共培養均可升高軟骨組織GAG水平(P<0.05)。

圖1 iPSC-MSCs體外對OA患者關節軟骨組織病理的影響 ×50

圖2 iPSC-MSCs體外對OA患者關節軟骨組織Ⅰ型膠原表達的影響 ×50

圖3 iPSC-MSCs體外對OA患者關節軟骨組織Ⅱ型膠原表達的影響 ×50

表1 iPSC-MSCs體外對OA患者關節軟骨組織GAG水平的影響

2.4 iPSC-MSCs體外對OA患者關節軟骨組織MMP-13、IL-6和IL-10分泌水平的影響檢測iPSC-MSCs與OA患者軟骨組織的共培養上清液，結果顯示(表2)，與對照組比較，IL-1β誘導組培養上清液中MMP-13、IL-6水平升高(P<0.01)，IL-10水平下降(P<0.01)；與IL-1β誘導組比較，iPSC-MSCs(1×105、1×106、1×107)細胞共培養可不同程度地降低培養上清液中MMP-13、IL-6水平，升高IL-10水平。

表2 iPSC-MSCs體外對OA患者關節軟骨組織MMP-13、IL-6和IL-10分泌水平的影響

3 討論

OA作為臨床常見的慢性炎癥性疾病，主要臨床癥狀包括慢性疼痛、關節不穩定、僵硬、關節 畸形和放射學關節間隙變窄[5]。關節軟骨主要由組織液、膠原(主要是Ⅱ型膠原)、蛋白聚糖和軟骨細胞組成。關節軟骨的退行性變化的標志是蛋白多糖含量減少和水含量增加[6]，由于關節軟骨缺乏血液供應，而且軟骨細胞是高度分化的細胞，增殖和遷移能力差[7-8]，因此運用干細胞治療OA的療法最近幾年有了很大的發展，如骨髓來源間充質干細胞、脂肪來源間充質干細胞在治療OA患者中起到了抗炎和軟骨保護作用[9-10]。然而，干細胞治療仍有許多缺點需要克服，包括腫瘤形成的風險、倫理問題和移植排斥等。iPSCs與胚胎干細胞相似，由患者特異性成體細胞經誘導產生，具有在形態、自我更新和分化能力方面的優勢[11]。已有研究[12]指出，iPSC-MSCs可以有效抑制OA兔軟骨中炎癥因子IL-1β和TNF-α蛋白表達，通過單層培養使用iPSC-MSCs衍生的軟骨細胞，可以修復有缺陷的軟骨。課題組前期研究[4]顯示通過關節腔內注射iPSC-MSCs可以改善OA大鼠關節病理，具有的軟骨保護作用但對軟骨基質的保護作用機制尚未明確。

已有文獻[13]表明，在OA患者和動物模型中IL-6、IL-10的水平分別提高和下降，IL-6可以放大炎癥反應，加重軟骨組織損傷，IL-10誘導的2型巨噬細胞亞型在組織重塑中起到作用。本研究觀察了不同細胞數量iPSC-MSCs體外對KOA患者關節軟骨組織炎癥因子水平的影響，結果表明，iPSC-MSCs共培養可降低促炎因子IL-6水平，升高抗炎因子IL-10水平。因此，iPSC-MSC可通過抑制IL-6產生、促進IL-10分泌，減輕關節軟骨局部炎癥，從而改善OA患者軟骨組織損傷。

細胞外軟骨基質(extracellular Cartilage Matrix ，ECM)合成和分解代謝是影響OA發生發展的一個重要影響因素。OA早期和晚期的滑膜炎與軟骨的改變有關，發炎的滑膜產生分解代謝和促炎因子，導致產生多余的蛋白水解酶，最終導致軟骨分解。其中MMP-13是軟骨退行性變化的關鍵酶，具有強大的基質分解作用，可降解多種膠原，參與結締組織的重構，它被認為是OA發病過程中發生的退行性過程的主要促成因素。OA發生時，軟骨組織Ⅰ型膠原水平升高，Ⅱ型膠原水平下降。本研究進一步觀察了iPSC-MSCs對OA患者軟骨組織ECM合成與降解蛋白表達的影響，結果表明iPSC-MSCs可以上調ECM中Ⅱ型膠原蛋白表達；下調Ⅰ型膠原蛋白表達，維持軟骨基本結構。GAG含量與軟骨生物力學特性存在高度相關性，已有研究[14]表明GAG含量的降低會影響軟骨的剛度和黏彈性，會導致更多的關節軟骨損傷。本研究結果表明，iPSC-MSCs與關節軟骨組織共培養，與IL-1β誘導組降低GAG水平相比，iPSC-MSCs(1×105、1×106、1×107)細胞可升高軟骨組織GAG水平，促進軟骨基質的合成。目前以MSC移植作為OA的臨床治療仍然還處于起步階段，MSC的不同種類、作用效果、作用機制以及安全性等還不是非常明確。iPSC來源的MSCs具有來源簡單、細胞質量可控、不涉及倫理學問題等優勢，是如今研究的熱點。本實驗主要觀察iPSC-MSCs與OA患者軟骨組織共培養對炎癥導致軟骨基質降解保護作用的機制，證實iPSC-MSCs抑制炎癥因子釋放，促進抗炎因子合成，抑制ECM降解。