ZIF-8-Pt納米顆粒對乳腺癌的放療増敏作用研究

鐘 凱，趙正陽，懷 千，李笑秋

作者單位：安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤科，合肥 230022

乳腺癌是女性常見的第2大惡性腫瘤[1]，其發病率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅著女性的生命健康。目前，乳腺癌的治療方法有手術、內分泌治療、放療、化療等。放療(radiotherapy,RT)作為傳統治療手段之一，在乳腺癌的局部治療中占有重要地位，但腫瘤病灶內部的劑量衰減以及腫瘤微環境的乏氧抵抗，會在一定程度上影響放療療效[2-3]。該研究旨在通過設計一種多孔鉑納米顆粒作為新的納米藥物來解決這個問題。由于高Z元素(是指鉑在元素周期表上的高原子序數)和氧氣生成功能的綜合優勢，鉑納米顆粒可以與目標DNA相結合，顯著增強放療過程中的DNA損傷[4-6]。此外，鉑納米顆粒通過將內源性H2O2轉化為O2來增加腫瘤的氧合作用，大大增強了放療效果，有良好的生物安全性，從而達到理想的放療增敏效果。

1 材料與方法

1.1 材料2-甲基咪唑、水合硝酸鋅購自上海阿拉丁試劑公司；氯鉑酸、硼氫化鈉購自上海國藥集團試劑有限公司；DMEM培養液、胰酶(濃度0.25%)購自美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司；溴化噻唑藍四氮唑(MTT)購買自生工生物工程(上海)股份有限公司；20只體質量20 g左右的6～8周齡的雌性Balb/c小鼠購自安徽醫科大學實驗動物中心并在SPF級動物房進行飼養。

1.2 方法

1.2.1ZIF-8-Pt納米顆粒的制備以及表征的測定 2-甲基咪唑1 ml(0.2 mol/L)與水合硝酸鋅100 μl(0.1 mol/L)劇烈反應，待到溶液呈乳白色停止反應。取反應液離心5 min(5 000 r/min)后去除沉淀，取上清液。上清液離心5 min(8 000 r/min)后取其沉淀，并搖勻重懸于1 ml去離子水中，再加入含有0.019 mol/L氯鉑酸的去離子水50 μl攪拌1 h，后加入100 μl硼氫化鈉(4 mg/ml)，再攪拌3 h得到ZIF-8-Pt納米顆粒。尺寸和電勢以及血清穩定性的測量是在Malvern ZS90動態光散射(DLS)儀器(Malvern Instruments Ltd.，Worcs，英國)上使用He-Ne激光(633 nm)和90個收集光學器件在水溶液中進行的。使用Malvern分散技術軟件5.10分析數據。使用透射電子顯微鏡(TEM；JEM-F200，JEOL Ltd，日本)觀察到ZIF-8-Pt納米顆粒的形態。取出樣品，離心后得沉淀ZIF-8-Pt納米顆粒，用硝酸溶解ZIF-8-Pt納米顆粒，再用王水溶解瓶中殘留物質，加入去離子水定容到5 ml后用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)去測量Pt的濃度。計算出單個樣品Pt的含量。使用便攜式溶解氧(DO)儀(Seven2GOproS9DO，Mettler Toledo，中國)測量水溶液中的氧氣生成。將ZIF-8-Pt納米顆粒的儲備溶液以各種濃度分散和稀釋在脫氧水中，然后在溫和攪拌下與H2O2水溶液混合。H2O2的最終濃度為0.001 mol/ml，混合物的總體積為8 ml。使用溶解氧儀每60 s實時測量一次溶液中的氧氣濃度。

1.2.2細胞培養 使用1%的雙抗(100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素)及10%的胎牛血清的DMEM培養基培養所需的4T1細胞并在37 ℃、5% CO2溫箱進行孵育。用倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態，當細胞生長到占培養皿80%時進行傳代，選對數生長期細胞進行實驗。

1.2.3ICP-MS測量細胞對顆粒的攝取情況 細胞計數后將4T1細胞種植到24孔板上，平均每孔種104個細胞。CO2溫箱孵育24 h后，每孔加入50 μg/ml的ZIF-8-Pt納米顆粒溶解于DMEM培養基所形成的溶液。以攝取時間2、4、6 h分為3組，每組有3孔，攝取納米顆粒后用1×PBS清洗孔內殘留液體并用胰酶消化吸出孔內貼壁細胞。用硝酸溶解各組細胞后高溫煮直至瓶底只見一層灰色物質附著，再用王水溶解瓶中殘留物質，加入去離子水定容到5 ml后用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)去測量Pt的濃度。

1.2.4MTT實驗評估ZIF-8-Pt 納米顆粒的毒性 以ZIF-8-Pt納米顆粒中Pt的濃度將實驗設置為5組：200、100、50、25、12.5 μg/ml。將4T1細胞種植到96孔板上，每孔5 000個細胞，孵育24 h后去除上清液培養基，分別加入5種濃度的納米顆粒溶液。繼續孵育24 h后，每孔加入25 μl 5 mg/ml MTT溶液，孵育4 h后，棄去舊培養基，每孔加入100 μl DMSO混勻，搖床震蕩1 h后，酶標儀488 nm波長進行檢測。用軟件Excel 2013和 GraphPad．Prism．V8.0．處理測好的對應孔的吸光度(optical density，OD)值，根據存活率=(實驗組-空白對照組)/(陰性對照組-空白對照組)×100%的公式計算細胞存活率。

1.2.5評估納米顆粒聯合放療對乳腺癌細胞的殺傷效果 實驗設置為3組：空白對照組(不含ZIF-8-Pt納米顆粒，且不放療)，聯合放療組(其中加入ZIF-8-Pt納米顆粒50 μg/ml)，單純放療組(不含ZIF-8-Pt納米顆粒)。以放療劑量將實驗設置為4組：0 Gy；1 Gy；3 Gy；6 Gy。分別將4T1細胞種入5塊96孔板，孵育24 h后，去除廢棄培養基，每塊96 孔板都加入50 μg/ml的ZIF-8-Pt納米顆粒或者相同體積的DMEM。孵育6 h后分別對每塊96孔板實施不同劑量的放療，再孵育24 h。之后用MTT法評估細胞的存活率。

1.2.6克隆形成實驗驗證納米顆粒聯合放療對乳腺癌細胞的殺傷與其顆粒濃度呈劑量相關 實驗設置為5組：① 單純放療組(即不加入顆粒)，② RT+NP 200 μg/ml，③ RT+NP 100 μg/ml，④ RT+NP 50 μg/ml，⑤ RT+NP 25 μg/ml。6孔板每孔接種1 000個4T1細胞(2 ml DMEM)，每組取兩個孔，培養箱過夜。分別加入不同濃度的納米顆粒，4 h后給予6 Gy劑量的放療，換液后放回培養箱繼續無菌培養5 d，取出6孔板，PBS洗1次，用結晶紫染色1 h，PBS洗凈(5次)拍照觀察計算。根據存活率=實驗組(NP+RT)/(單純放療組)×100%的公式計算細胞存活率。

1.2.7構建4T1小鼠腫瘤模型 20只20 g左右6～8周齡的雌性 Balb/c 小鼠購自安徽醫科大學動物房。 所有動物均按照《實驗動物護理和使用指南》中概述的指南進行飼養，所有程序均經中國科學技術大學動物護理和使用委員會批準。將2×105個4T1細胞(重懸于100 μl 1×PBS中)注射到Balb/c小鼠的右側腰部皮下，建立腫瘤模型。

1.2.8評估納米顆粒聯合放療體內對乳腺癌的殺傷效果 當荷瘤小鼠腫瘤體積約為100 mm3時，4T1荷瘤小鼠靜脈注射以下分組的制劑(每組n=4)。注射后12 h，小鼠接受或者不接受6 Gy劑量的X射線照射。① PBS組(即既不加入顆粒也不經過放療)，② 單純放療組(即不加入顆粒)，③ 單純顆粒組(即只加入顆粒卻不經過放療)，④ 顆粒聯合放療組(RT+NP 50 μg/ml)，注射的顆粒ZIF-8-Pt的劑量為每千克小鼠注射2 mg劑量的ZIF-8-Pt制劑(ZIF-8-Pt納米顆粒溶于1×PBS所形成的與體內等滲的溶液)。通過每2 d使用卡尺測量腫瘤的垂直直徑(即分別為長度和寬度)來監測腫瘤生長。根據以下公式計算估計體積：腫瘤體積(mm3)=0.5×長度×寬度2。并且每2 d測量每只小鼠的體質量。

1.2.9HE染色檢測納米顆粒聯合放療后對腫瘤以及其他臟器組織結構的破壞 X射線照射15 d后處死小鼠，取出腫瘤以及小鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器；測量每塊腫瘤的重量。腫瘤以及臟器用4%甲醛固定，石蠟包埋。隨后，通過HE染色觀察。

圖1 ZIF-8-Pt納米顆粒相關表征

2 結果

2.1 ZIF-8-Pt納米顆粒的表征通過DLS測量得出ZIF-8-Pt納米顆粒的粒徑在160 nm左右(圖1 A)，與透射電鏡觀察的結果一致(圖1 B)；其電勢為-14 mV(圖1 C)； DLS測量ZIF-8-Pt納米顆粒在10%的FBS中可以穩定存在，粒徑維持在200 nm左右(圖1 D)；通過將H2O2溶液與各種濃度的ZIF-8-Pt納米顆粒混合后測量水溶液中的溶解氧濃度來評估該顆粒的氧氣產生能力，氧氣產生的程度高度取決于溶液中ZIF-8-Pt納米顆粒的濃度，ZIF-8-Pt納米顆粒的濃度為50 μg/ml時產生氧氣的能力明顯強于25 μg/ml以及不加顆粒的對照組(圖1E)；ICP-MS測量合成ZIF-8-Pt納米顆粒樣品中Pt的含量為837.8 μg。

2.2 細胞對ZIF-8-Pt納米顆粒的攝取4T1細胞與ZIF-8-Pt納米顆粒共同孵育2、4、6 h后，經過ICP-MS測量，4T1細胞對顆粒的攝取率分別為28.9%、34.4%、39.4%，細胞對顆粒的攝取隨著時間的延長而增多。

2.3 ZIF-8-Pt顆粒的生物安全性該實驗測試了各種濃度(0～200 μg/ml)的ZIF-8-Pt 顆粒的細胞毒性。將4T1細胞與ZIF-8-Pt 顆粒共孵育6 h并在24 h后測量生存率，當顆粒濃度為50 μg/ml時細胞存活率為89.28%(P<0.05)，差異有統計學意義，但總體來說具有較好的生物安全性(圖2)。

圖2 不同濃度 ZIF-8-Pt 顆粒的生物安全性

2.4 MTT法評估體外放療増敏效果為了評估4T1的放療増敏效果，將4T1細胞用ZIF-8-Pt納米顆粒以50 μg/ml的濃度處理6 h，對照組用1×PBS處理6 h。然后分別以0、1、3、6 Gy的劑量給予放療，24 h后使用MTT法測定細胞活力(圖3)。與單純放療組相比，用ZIF-8-Pt納米顆粒預處理的細胞在放療后顯示出更高的細胞死亡率，在給予6 Gy劑量的放療時，聯合放療組的細胞存活率僅為(50.096±12.948)%，明顯低于單純放療組的(80.391±15.628)% (P=0.010 2，t=2.968)，差異有統計學意義，這表明ZIF-8-Pt納米顆粒具有放療增敏效果。

圖3 ZIF-8-Pt納米顆粒在不同放療劑量下對4T1細胞的殺傷效果

2.5 克隆形成實驗驗證納米顆粒聯合放療對4T1細胞的殺傷效果與其顆粒濃度相關通過克隆形成試驗進一步評估了ZIF-8-Pt納米顆粒的放療增敏效果。將4T1細胞與不同濃度的ZIF-8-Pt 顆粒孵育4 h，然后給予6 Gy處理。 在照射5 d后檢查每組4T1細胞的集落形成(圖4 A)。通過計數集落數確定的細胞存活分數隨著ZIF-8-Pt納米顆粒濃度的增加而下降。當顆粒濃度達到200 μg/ml時，細胞存活率最低，僅為21%(圖4 B)。

2.6 ZIF-8-Pt納米顆粒的體內放療增敏效果在ZIF-8-Pt納米顆粒體外治療實驗的基礎上，本研究進一步在小鼠體內驗證顆粒的放療增敏效果。以2 mg/kg劑量的ZIF-8-Pt納米顆粒聯合6 Gy的電離輻射進行體內治療實驗。4T1荷瘤小鼠注射不同的納米顆粒溶液或PBS，12 h后，用6 Gy的X射線照射腫瘤。最終結果顯示(圖5 A)，NP+RT組有效抑制了78.4%的腫瘤生長(F=10.95，P<0.000 1)，明顯強于單純放療組的34.5% (F=10.95，P=0.012 7)與單純顆粒組的19.1%，(F=10.95，P=0.003 0)，差異有統計學意義，說明了體內高Z元素ZIF-8-Pt的放療增敏效果。在RT治療后第15天處死小鼠，取出腫瘤后觀察(圖5D)并且測量治療后腫瘤的重量(圖5 C)，其中經ZIF-8-Pt聯合放療治療組腫瘤重量明顯輕于單純放療組的腫瘤重量(F=11.76，P=0.044 4)，差異有統計學意義，同樣證明了ZIF-8-Pt 聯合放療明顯優于單純放療。治療前后小鼠體質量無明顯變化(圖5 B)，可以說明ZIF-8-Pt在體內具有較好的生物安全性。在RT治療后第15天解剖小鼠獲取腫瘤以及臟器并進行HE染色(圖5 E)，各治療組對小鼠的臟器均未有明顯損傷，這不僅可以說明ZIF-8-Pt 聯合放療對腫瘤組織的殺傷效果優于單純放療，也可以說明ZIF-8-Pt納米顆粒在小鼠體內具有良好的生物安全性。

3 討論

放射治療是目前臨床上廣泛應用的治療方法之一。RT利用高能X射線直接損傷DNA或產生活性氧自由基殺死癌細胞[7]。但是由于放療缺乏組織特異性以及靶向性，且腫瘤部位相對乏氧，會導致放療后斷裂的DNA周圍缺少足夠的O2形成的穩定氧化合物，不能有效地抑制DNA損傷的自動修復，從而導致放療效果不明顯。目前增敏放療的策略是將血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，趨化因子受體(chemokine receptor 4,CXCR4)，雄激素受體作為增敏靶點，通過抑制細胞增殖并誘導凋亡來增強放療對細胞的殺傷作用，但是由于放療抵抗機制網絡的復雜性導致針對靶點治療的療效不明顯[8-9]。因此如何通過改善腫瘤的乏氧微環境從而緩解放療抵抗是目前的一個研究熱點。

圖4 驗證ZIF-8-Pt納米顆粒對4T1細胞的殺傷效果與其濃度之間的關系

本研究所設計并制備的ZIF-8-Pt納米顆粒具備三點優勢。① 可以通過其“高滲透長滯留”效應(enhanced permeability and retention effect, EPR)效應來發揮被動靶向和腫瘤富集的作用[10-12](EPR效應是指由于正常組織中的微血管內皮間隙致密、結構完整，大分子和脂質顆粒不易透過血管壁，而實體瘤組織中血管豐富、血管壁間隙較寬、結構完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子類物質和脂質顆粒具有選擇性高通透性和滯留性，可以使ZIF-8-Pt納米顆粒在腫瘤部位靶向富集。)。② ZIF-8-Pt納米顆粒，作為一種多孔鉑納米顆粒，由于具備高Z元素的優勢，可以在在與腫瘤中的X射線相互作用后有效地發射電子輻射，從而最大限度地增強放療誘導的DNA損傷、細胞周期停滯和ROS應激[13]。③ ZIF-8-Pt納米顆粒可以通過將內源性H2O2轉化為O2，改善乏氧微環境，進而增強了RT的療效[14]。材料的表征結果顯示，ZIF-8-Pt納米顆粒可以有效地促進H2O2轉化為O2；體內以及體外治療實驗結果顯示，ZIF-8-Pt納米顆粒聯合放療對乳腺癌的殺傷效果明顯強于單純放療，并且聯合ZIF-8-Pt納米顆粒的放療不會導致小鼠出現明顯的器官毒性跡象或體質量變化，保證了材料具有增敏放療效果的同時具備良好的生物安全性。