Bobs技術(shù)在胎兒染色體異常產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用研究

鄢 一

（葫蘆島市中心醫(yī)院，遼寧 葫蘆島 125000）

傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)分析方式是進(jìn)行產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，這種分析方式不僅能夠明確染色體的具體狀況，還能明確其中的數(shù)目異常和大片段缺失的結(jié)構(gòu)異常，但這種診斷方式需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，在各項(xiàng)操作過程中步驟較多，想要對(duì)其進(jìn)行完善的質(zhì)量控制具有較大的難度[1]。也在臨床研究中發(fā)現(xiàn)這種診斷方式對(duì)于顯微鏡的要求較高，而目前來說我國(guó)應(yīng)用的細(xì)胞遺傳診斷顯微鏡分辨率有限，無法檢測(cè)出小于5 Mb且具有臨床意義的染色體微缺失綜合征，在進(jìn)行各項(xiàng)操作時(shí)具有較高的操作難度，需要專業(yè)人員進(jìn)行分析[2]。近幾年新推出的細(xì)菌人工染色體標(biāo)記微球陣列技術(shù)，能夠同時(shí)對(duì)臨床上最為常見的5種染色體非整倍體以及染色體微缺失癥進(jìn)行診斷，在臨床上屬于一種特異性較高且高通量的快速產(chǎn)前診斷技術(shù)[3-5]。本次研究將2018年6月至2020年1月作為研究時(shí)段，在該時(shí)段內(nèi)錄入葫蘆島市中心醫(yī)院中接受常規(guī)體檢的3 000例單胎中期妊娠產(chǎn)婦作為研究對(duì)象，探究將細(xì)菌人工染色體微球檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于胎兒染色體異常產(chǎn)前診斷中的效果，分析其臨床可用性，現(xiàn)將結(jié)果方法總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2018年6月至2020年1月作為研究時(shí)段，在該時(shí)段內(nèi)錄入葫蘆島市中心醫(yī)院中接受常規(guī)體檢的3 000例單胎中期妊娠產(chǎn)婦作為研究對(duì)象，所有產(chǎn)婦在入院時(shí)存在高齡、染色體家族史、超聲結(jié)構(gòu)或軟指標(biāo)異常、無創(chuàng)DNA檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)等狀況。所有產(chǎn)婦的年齡信息區(qū)間介于23～32歲，平均年齡（28.40±3.70）歲，產(chǎn)婦孕周為18～21周，平均孕周（19.89±1.21）周。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者在入院時(shí)基本資料納入研究并接受體征檢測(cè)，確認(rèn)符合臨床疾病。②患者可耐受本次試驗(yàn)中各項(xiàng)操作。③患者基本資料錄入數(shù)據(jù)庫(kù)后可接受調(diào)取。④患者自愿簽署知情同意書，研究?jī)?nèi)容符合我院倫理審查標(biāo)準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者因主觀因素?zé)o法參與后續(xù)試驗(yàn)或無法耐受試驗(yàn)操作。②患者處于疾病恢復(fù)期或在接受試驗(yàn)前3個(gè)月接受過其他試驗(yàn)。③患者家屬不同意本次試驗(yàn)。

將3 000例單胎中期妊娠產(chǎn)婦資料錄入Excel表格后進(jìn)行資料綜合分析，葫蘆島市中心醫(yī)院統(tǒng)計(jì)學(xué)人員分析患者資料，確認(rèn)患者資料可比其良好后錄入研究，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 Bobs檢測(cè) 常規(guī)抽取羊水10 mL，對(duì)樣本進(jìn)行離心處理，速度為2 000 r/min，離心處理5 min，去除生物氫液后，保留細(xì)胞對(duì)胎兒羊水細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行檢查，使用美國(guó)Qiagen公司生產(chǎn)的QIAamp DNA Blood Mini Kit提取。確認(rèn)樣本的DNA濃度與純度根據(jù)其具體狀況做好相應(yīng)的標(biāo)記和純化，使用美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)的NAN DROP 2000測(cè)定樣本的濃度與純度。使用芬蘭Perkin Elmer公司生產(chǎn)的obsAssay試劑盒標(biāo)記、純化基因組DNA。采用Bobs探針進(jìn)行雜交，做好DNA洗滌，常規(guī)檢測(cè)雜交分子的熒光強(qiáng)度針對(duì)其中存在的問題，使用美國(guó)Luminex公司生產(chǎn)的Luminex200來測(cè)定雜交分子的熒光強(qiáng)度。應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件（Bobsoft 2.0版）進(jìn)行計(jì)算分析，生成結(jié)果數(shù)據(jù)后進(jìn)行判斷。

Bobs檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn)：正常比值為（1.00±0.02）。若大于正常比值，則為片段重復(fù)；若小于正常比值，則為片段缺失。

1.2.2 G顯帶染色體核型分析 取羊水樣本量20 mL，將其進(jìn)行離心后接種放置于37 ℃、5% CO2恒溫箱中進(jìn)行連續(xù)7 d培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行更換后24 h進(jìn)行收獲以及制片，G顯帶后核型分析。由我院中相關(guān)醫(yī)務(wù)人員對(duì)圖像進(jìn)行檢測(cè)分析。分析以上細(xì)胞核型，計(jì)數(shù)大于（或等于）10個(gè)克隆分裂相，根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名的國(guó)際體制（ISCN）》標(biāo)準(zhǔn)2009（ISCN2009）診斷。

1.2.3 全基因組SNP微陣列檢測(cè) 應(yīng)用因芯片（美國(guó)Affymetrix Genome CytoScan 750K）根據(jù)操作要求對(duì)DNA進(jìn)行處理，包括DNA消化處理、擴(kuò)增處理、純化、片段化處理、標(biāo)記信號(hào)處理、雜交處理、洗片染色處理及掃描處理等。使用軟件（Chromosome Analysis Suite）來對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與判定。

全基因組SNP微陣列檢測(cè)的判定標(biāo)準(zhǔn)：200 kb為拷貝數(shù)變異的報(bào)告閾值缺失；500 kb為片段重復(fù)。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)比分析染色體核型分析診斷、Bobs診斷、基因芯片診斷在胎兒染色體異常產(chǎn)前診斷中的效果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本次試驗(yàn)中3 000例單胎中期妊娠產(chǎn)婦統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)由醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行記錄，將其錄入統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS21.00 For Windows后進(jìn)行整理分析，數(shù)據(jù)選擇χ2、t進(jìn)行分析，確認(rèn)計(jì)算結(jié)果P值與0.05關(guān)系，若P＜0.05則說明本次研究結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，反之則統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不存在。

2 結(jié)果

在本次研究結(jié)果中顯示，3 000例產(chǎn)婦中染色體核型分析檢出各類異常共219例，其中存在165例染色體非整倍體數(shù)目異常狀況（包含：21-三體、21-三體與精曲小管發(fā)育不全、18-三體、13-三體、45XO），染色體非整倍體數(shù)目異常狀況占比為75.34%；54例患者為染色體結(jié)構(gòu)異常（包含：微缺失/微重復(fù)、易位、倒位、Bob易位、性染色體嵌合體），為染色體結(jié)構(gòu)異常占比為24.64%。而在Bobs診斷結(jié)果中，其非整倍體數(shù)目異常診斷結(jié)果與G顯帶核型分析結(jié)果完全一致，出現(xiàn)4例漏診狀況，并且其診斷結(jié)果與基因芯片檢測(cè)結(jié)果一致。見表1。

表1 3種患者診斷準(zhǔn)確率對(duì)比

3 討 論

嬰兒出生缺陷是指出生前發(fā)生的結(jié)構(gòu)、功能或代謝異常。隨著二胎政策的開放，多數(shù)年齡較大的孕婦的數(shù)量不斷增加，胎兒出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)也不斷增加。據(jù)調(diào)查，我國(guó)每年約發(fā)生90萬(wàn)例胎兒出生缺陷，這已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。產(chǎn)前診斷是預(yù)防出生缺陷的主要措施。例如，產(chǎn)前超聲能及時(shí)、有效地檢測(cè)胎兒結(jié)構(gòu)異常。染色體異常的篩選方法包括血清學(xué)篩選和非侵入性產(chǎn)前基因測(cè)試，產(chǎn)前診斷方法包括染色體核型分析、熒光原位雜交分析、染色體微陣列分析和細(xì)菌人工染色體標(biāo)記-微球鑒別/分離測(cè)定。染色體核型分析是胎兒產(chǎn)前診斷染色體異常檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[6]。

G顯帶染色體核型分析是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的人類染色體核型分析技術(shù)[7]，這種方式受到地域、標(biāo)本年齡以及試驗(yàn)條件等多因素的限制，導(dǎo)致核帶在處理過程中存在明顯差異，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的情況，在一定程度上影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性。臨床研究發(fā)現(xiàn)[8]，大約有16%的病例在G顯帶染色體核型分析中未檢出異常，而其中大約有10%為胎兒多發(fā)性畸形。隨著近年來醫(yī)療環(huán)境的不斷改善，G顯帶染色體核型分析的改良版將高分辨率的方案應(yīng)用于其中，這種方案能夠顯示出超過2 000條的染色體條帶，但這種檢驗(yàn)方式對(duì)于檢驗(yàn)人員提出了極高的要求，難以在臨床上推廣使用[9-10]。Bobs監(jiān)測(cè)方案在應(yīng)用過程中不僅操作簡(jiǎn)單，對(duì)于各種診斷方式具有較高的診斷準(zhǔn)確度，這種診斷技術(shù)對(duì)于探針覆蓋范圍內(nèi)的微重復(fù)病例即可明顯檢出，同時(shí)這種檢測(cè)方式無須對(duì)樣本進(jìn)行培養(yǎng)操作較為簡(jiǎn)單，對(duì)于大多數(shù)醫(yī)務(wù)人員均有較好的適應(yīng)度。

產(chǎn)前診斷是減少出生缺陷的有效方法，染色體核型分析可以發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目異常和大于5～10 Mb的結(jié)構(gòu)異常，這是檢測(cè)產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。由于與畸形或智力發(fā)育有關(guān)的微缺失和微重復(fù)的檢測(cè)能力有限，因此存在漏診的風(fēng)險(xiǎn)。

染色體微陣列分析技術(shù)包括基因芯片分析單核苷酸多態(tài)性和陣列比較基因組雜交，它不僅能檢測(cè)染色體非整倍體，還能檢測(cè)微缺失以及微重復(fù)。國(guó)內(nèi)外指南建議在產(chǎn)前超聲顯示胎兒結(jié)構(gòu)異常時(shí)，選擇染色體微陣列分析進(jìn)行基因檢測(cè)。染色體核型分析結(jié)合嵌合體檢測(cè)對(duì)于產(chǎn)前診斷和合適的遺傳咨詢進(jìn)行更全面、更準(zhǔn)確的篩查具有重要意義。然而，該技術(shù)不僅可以檢測(cè)到染色體的異?？截悢?shù)，而且可以檢測(cè)到染色體的異?？截悢?shù)，這使得結(jié)果的解釋更加困難和昂貴，對(duì)孕產(chǎn)婦的經(jīng)濟(jì)壓力更大。產(chǎn)前Bobs技術(shù)的應(yīng)用彌補(bǔ)了傳統(tǒng)染色體核型分析的不足，報(bào)告周期短，結(jié)果清晰易讀，在快速產(chǎn)前診斷方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

雖然Bobs診斷方式具有一定的瓶頸性[11-12]，無法檢測(cè)多倍體，同時(shí)對(duì)于低比例的染色體異常嵌合檢出能力存在一定的限制，但總體來說依舊屬于一種高效且快速的產(chǎn)前診斷方式，為了避免這種診斷方式的瓶頸性，可以在臨床上將其與G顯帶染色體核型分析應(yīng)用于患者的診斷中，能夠起到互補(bǔ)的效果，這樣能夠提高產(chǎn)前診斷染色體非準(zhǔn)備數(shù)目異常的檢出率，對(duì)于優(yōu)生優(yōu)育率的提升來說效果良好[13]。

Bobs診斷的主要優(yōu)勢(shì)為準(zhǔn)確度、特異度和靈敏度較高，基因芯片在染色體微缺失、微重復(fù)方面的診斷中效果突出。該方法是一種基于微珠的多重檢測(cè)方法，目標(biāo)區(qū)域代表位點(diǎn)，與現(xiàn)有的快速產(chǎn)前診斷檢測(cè)方法相比具有更大的疾病覆蓋率[14]。

綜上所述，Bobs診斷方式應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體異常診斷中能夠快速明確胎兒的異常狀況，其研究結(jié)果與G顯帶染色體核型分析與基因芯片檢測(cè)相似度較高，這種診斷方式診斷準(zhǔn)確率較高，并且診斷迅速，能夠早期明確胎兒的妊娠狀況，對(duì)于終止妊娠和后續(xù)治療工作的開展來說有積極意義，值得推廣。