宮頸癌組織中HPV16 E6、E7蛋白水平與患者臨床病理特征及預后的關系

路 玲，張媛媛，徐 瑤，吳寶華，徐 蕾，吳海燕

(1.成都醫學院第一附屬醫院婦科，四川 成都 610500；2.新疆醫科大學附屬腫瘤醫院婦科，新疆 烏魯木齊 830054)

宮頸癌是全球女性最常見的生殖系統惡性腫瘤，據統計2018年全球宮頸癌新發病例超過56萬人，由于宮頸癌導致的死亡病例超過31萬人[1]。宮頸癌是我國女性發病率第二高的惡性腫瘤，早期宮頸癌由于癥狀和體征不明顯易被忽略，導致疾病的進展和蔓延，晚期宮頸癌患者預后通常較差，五年生存率低于40%，嚴重威脅我國女性健康安全[2]。過去的研究已證實宮頸癌的發生發展與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染密切相關，目前HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35等15種高危型HPV已被報道參與宮頸癌的發生和進展[3]，其中又以HPV16、HPV18感染率最高，占所有高危型HPV感染的70%以上[4]。16型人乳頭瘤病毒E6蛋白(human papilloma virus type 16 E6 protein，HPV16 E6)和16型人乳頭瘤病毒E7蛋白(human papilloma virus type 16 E7 protein，HPV16 E7)均是HPV16基因編碼的蛋白質，相關研究表明其參與宮頸癌[5]、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[6]的發生和進展，但宮頸癌中HPV16 E6、HPV16 E7水平與患者臨床病理特征和預后的關系尚不完全明確，本研究通過免疫組織化學法檢測宮頸癌組織中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表達情況，旨在為宮頸癌患者的治療及預后評估提供相關依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月—2018年3月于成都醫學院第一附屬醫院行宮頸癌根治術的宮頸癌患者87例，年齡25～73歲，平均(50.11±10.14)歲；采用國際婦產科聯盟(International Federation of Obstetrics and Gynecology，FIGO)標準進行分期，其中ⅠA期～ⅠB1期56例，ⅠB2期～ⅡA期31例；中、高分化60例，低分化27例。留取每例患者術中切除的腫瘤組織、癌旁組織(距腫瘤組織>2 cm)、正常宮頸組織標本，每種組織標本為一組。本研究中選取的左右組織均為宮頸癌根治術中收集到的腫瘤組織、癌旁組織以及正常組織，組織新鮮，經甲醛固定后采用石蠟包埋保存。納入標準：①患者均初發宮頸癌，診斷標準依據《宮頸癌診療規范(2018年版)》[7]；②患者身體狀況良好，能夠接受手術治療；③患者術前未接受放、化療、靶向治療及生物免疫治療；④患者未合并其他惡性腫瘤、自身免疫性疾病、精神神經疾病。排除標準：①患者為宮頸癌復發或其他臟器腫瘤轉移；②患者合并心臟、腎臟等重要臟器功能不全；③患者術前接受過放、化療、靶向治療及生物免疫治療。采用電話、微信、電子郵件、門診等方式對患者進行隨訪，隨訪間隔為3個月，隨訪患者死亡則停止隨訪，隨訪時間截止至2021年3月。本研究經醫院倫理委員會審核并通過，所有患者及家屬均知情同意且簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1試劑與耗材 HPV16 E6、HPV16 E7蛋白兔抗人一抗均購自美國SCBT公司；SP免疫組織化學法試劑盒、DAB-Kit顯色液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer salin，PBS)、蘇木精染液、中性樹膠均購自北京中杉金橋生物遇險公司；高性能組織病理切片、光學顯微鏡均購自德國徠卡公司。

1.2.2免疫組織化學法檢測HPV16 E6、HPV16 E7表達水平 將病理組織切片采用二甲苯脫蠟處理，梯度乙醇水化后滴加3%過氧化氫溶液封閉15 min消除內源酶，加入檸檬酸型抗原修復液(pH=6.0±0.1)，采用高壓抗原修復法修復抗原，冷卻后使用PBS沖洗，滴加山羊血清封閉內源性生物素。HPV16 E6、HPV16 E7一抗均按照說明書所示進行1∶100稀釋，與切片在4 ℃濕盒中孵育過夜，次日PBS沖洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫下孵育1 h，PBS沖洗后滴加DAB-Kit顯色30 s左右，水洗終止顯色，再滴加蘇木精復染1 min，梯度酒精脫水后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并對染色結果進行評分。

1.2.3結果判讀 顯微鏡下觀察HPV16 E6、HPV16 E7蛋白均表達于細胞核和細胞漿中，但主要在細胞核中表達。以鏡下出現棕黃色顆粒為蛋白陽性表達，高倍鏡下隨機取5個視野并計數1 000個細胞，根據陽性細胞所占比例進行評分。根據染色強度評分：未著色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、褐色為3分；根據陽性細胞所占比例進行評分：<10%為0分、10%～40%為1分、40%～70%為2分，>70%為3分。以上述兩項得分相乘，<2分為蛋白陰性表達，2～3分為(+)，4～7分為(++)，≥8分為(+++)，已評分≥2分為蛋白陽性表達。

1.3統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier生存曲線比較患者生存情況，采用COX回歸分析各項因素對患者預后的影響。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同組織中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表達情況 癌旁組織中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白陽性率高于正常組織，腫瘤組織中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白陽性率高于癌旁組織和正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同組織中HPV16 E6、E7蛋白陽性率比較

2.2HPV16 E6、HPV16 E7蛋白與臨床病理特征的關系 3中組織中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表達在不同的患者年齡、腫瘤組織學類型中差異無統計學意義(P>0.05)，但在腫瘤FIGO分期、分化程度、合并淋巴結轉移情況、肌層浸潤深度以及腫瘤直徑中差異有統計學意義(P<0.05)，見表2，3。

表2 HPV16 E6蛋白與臨床病理特征的關系

表3 HPV16 E7蛋白與臨床病理特征的關系

2.3HPV16 E6、HPV16 E7與患者生存率的關系 截至2021年3月，宮頸癌患者87例中存活60例，死亡25例，失訪2例，患者3年生存率68.97%，所有死亡患者均死于宮頸癌復發或進展。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示前宮頸癌組織HPV16 E6及HPV16 E7蛋白陽性表達患者3年生存率低于陰性表達患者，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 HPV16 E6、HPV16 E7表達與患者生存率的關系

2.4HPV16 E6、HPV16 E7與患者預后的關系 以患者預后(預后良好=0，預后不良=1)為自變量，以HPV16 E6(陰性=0，陽性=1)、HPV16 E7(陰性=0，陽性=1)、年齡(<50歲=0，>50歲=1)、FIGO分期(ⅠA～ⅠB1=0，IB2～ⅡA=1)、組織學分型(腺癌=0，鱗癌=1)、分化程度(低分化/中=0，高分化=1)、淋巴結轉移(未合并=0，合并=1)、肌層浸潤深度(<1/2=0，≥1/2=1)、腫瘤直徑(≤4 cm=0，>4 cm=1)，多因素分析顯示，HPV16 E6陽性、HPV16 E7陽性、FIGO分期(IB2～ⅡA)、肌層浸潤深度(≥1/2)、腫瘤直徑(>4 cm)均可作為宮頸癌患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 HPV16 E6、HPV16 E7與患者預后的多因素回歸分析

3 討 論

研究表明，宮頸癌的發生發展與HPV感染具有密切聯系，在宮頸癌組織中檢出率極高，持續HPV感染能夠引起宮頸不典型增生，是宮頸癌的常見誘因之一[8]。隨著醫學研究的進步，到目前為止人類已分離并鑒定了超過150種HPV基因型，并根據其致癌能力的差異將HPV分為主要引起良性病變的低危型HPV(如HPV6型、11型)和能夠引起細胞惡性轉化的高危型HPV(如HPV16型、18型)[9]。HPV是一種小型環狀DNA病毒，主要感染皮膚以及生殖器，但相關文獻報道HPV與口腔鱗癌、乳腺癌等惡性腫瘤的發生相關，但結果尚不完全明確[10-11]。

病毒蛋白HPV16 E6、E7與HPV的致癌性密切相關，研究顯示E6、E7蛋白不具備酶的活性，通過與宿主細胞內蛋白形成復合物的形式參與細胞生命活動的調控[11]。E6蛋白能夠與細胞內泛素連接酶結合并改變構象，特異性結合細胞內p53蛋白，導致p53泛素化并降解[12-13]，p53是目前已知具有最強的抑癌基因，E6通過降解p53表達產物抑制抑癌基因活性，從而參與腫瘤的發生和發展，具有較強的促腫瘤作用。而E7蛋白能夠與抑癌基因pRb產物特異性結合并導致其失活，導致細胞周期失控，抑制細胞凋亡過程，引起細胞過度增殖，誘導腫瘤疾病的產生[14]。相關研究表明HPV感染后E6、E7共同發揮作用，E7蛋白促進腫瘤的生長，而E6蛋白大大提高E7的致癌能力，僅E7蛋白異常表達常導致尖銳濕疣等良性病變的發生，而聯合E6蛋白異常表達則常導致惡性病變而發生。

本研究顯示宮頸癌組織中HPV16 E6、E7蛋白陽性率明顯高于癌旁組織和正常組織，且與腫瘤FIGO分期、分化程度、合并淋巴結轉移情況、肌層浸潤深度以及腫瘤直徑相關，提示宮頸癌組織中HPV16 E6、E7蛋白存在過表達情況，且促進腫瘤的生長和進展。李芳等[15]研究顯示HPV16 E6、E7 DNA水平升高對宮頸癌淋巴結轉移具有預警作用，可作為反映宮頸癌淋巴結微轉移的指標；王慧玲等[16]研究顯示抑制宮頸癌細胞中HPV16 E6、E7蛋白的表達能夠抑制宮頸癌細胞的上皮間質轉化過程，促進腫瘤細胞的凋亡。上述結果均反映HPV16 E6、E7蛋白過表達促進了宮頸癌的發生和發展。本研究結果顯示HPV16 E6、E7蛋白陽性的宮頸癌患者3年生存率低于陰性患者，單因素回歸分析結果顯示HPV16 E6、E7蛋白陽性表達均能夠給增加患者死亡風險，而多因素回歸分析結果顯示HPV16 E6、E7蛋白陽性表達均與患者預后不良相關，可作為患者預后的獨立預測指標發揮臨床作用。

綜上所述，宮頸癌患者腫瘤組織中HPV16 E6、E7蛋白呈高表達，且與患者臨床病理特征和預后相關，可作為患者預后的獨立預測指標，可能為宮頸癌診斷和治療的提供相關靶點，本研究的不足之處在于研究樣本量較少，且能夠對HPV16 E6、E7蛋白促進宮頸癌發生發展的機制進行研究，需要在后續研究中加以補足。