脊髓背角環磷酸腺苷直接激活的交換蛋白在大鼠炎性痛中的作用

陳彬彬 張一肖 王 振 萬海方

炎性痛是臨床上常見的癥狀之一，急性炎性痛（1 個月以內的疼痛）往往是保護性疼痛，而慢性炎性痛（持續超過3 個月的疼痛）作為一種病理性疼痛，不僅降低了患者生活質量，也會引起鎮痛藥物的濫用，甚至引發社會心理問題[1]。因此，有效鎮痛尤為重要。環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）直接激活的交換蛋白（exchange protein directly activated by cAMP，Epac）在疼痛調節過程中發揮了重要作用[2]，可將與Rap 蛋白結合的二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP）置換為三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP），激活Rap 蛋白[3]，包括Epac1 和Epac2 兩種亞型。其中Epac1 在中樞或外周神經系統、血管內皮細胞等組織中廣泛表達[4]。下丘腦室旁核（paraventricular nucleus，PVN）Epac1 蛋白參與了弗氏完全佐劑（Freund's complete adjuvant，CFA）誘導的慢性炎性痛[5]，而Epac 蛋白在脊髓水平參與調節炎性痛過程的相關研究較少。脊髓背角是外周傷害性信息傳入通路的第一級中轉站，也是疼痛信號傳遞與整合的初級中樞[6]。因此，本研究采用CFA 誘導的大鼠炎性痛模型，探討脊髓背角Epac 蛋白在炎性痛中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康成年雄性SD 大鼠84只，3 月齡，體質量230～250 g，實驗動物許可證號：SCXK（魯）20140007。所有大鼠置于22～24 ℃，晝12 h夜12 h 節律光照中，自由飲水攝食，實驗前靜養1周。實驗過程中對動物的處置符合相關動物倫理學處理標準條例。

1.2 實驗試劑及儀器 Epac1 抗體（貨號ab21236）和抗Epac2 抗體（貨號ab21238）均購自美國Abcam公司；抗GAPDH 抗體（貨號AC001）購自美國ABclonal 公司；抗c-Fos 抗體（貨號#2250）購自美國Cell Signaling Technology 公司；CFA（貨號F5881）購自美國Sigma 公司；8p-CPT-2'-O-Met-cAMP（8p-CPT）（貨號4853）購自英國Tocris 公司；熱痛敏刺激儀（ⅡTC series 8-309）購自中國醫學科學院生物工程研究所；激光共聚焦顯微鏡（FV1000）購自Olympus。

1.3 實驗模型及分組 取20 只大鼠做非模型鼠，余64 只大鼠參照文獻[7]的方法建立炎性痛模型。分別在大鼠雙側后爪趾底皮下注射CFA 100 μL（以下稱為建模），大鼠雙側后爪出現紅、腫等炎癥表現，表明模型制備成功。本實驗研究中炎性痛大鼠模型均制備成功。將大鼠按隨機數字表法分為三組：對照組（C組）、生理鹽水組（NS 組）和Epac 激動劑8p-CPT 組（8p-CPT 組），每組12 只。其中C 組為非模型鼠，不做任何處理，NS 組和8p-CPT 組為模型鼠，分別于建模后6 d，鞘內給予NS、Epac 激動劑8p-CPT 10 μL（以下稱為給藥）。

1.4 Western blot 法 于建模前及建模后1、3、6、9、14 d 檢測大鼠Epac1、Epac2 蛋白含量，每個時間點檢測4 只，共24 只。將大鼠予10%水合氯醛麻醉后，取大鼠腰膨大L4-6脊髓，放入預冷的裂解液中，于冰上充分勻漿，每個樣本勻漿3 次，每次10 s，間隔5 s冷卻，離心15 min 后吸取上層清液，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法行樣本蛋白濃度測定，配平后加入上樣緩沖液，放入沸水中促使蛋白變性。10% SDS-PAGE 電泳分離目標蛋白（Epac1、Epac2和GAPDH），濕轉至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h后分別加入1∶1000 稀釋后的一抗，4 ℃孵育過夜，復溫后分別加入堿性磷酸酶標記的1∶1000 稀釋后的二抗，避光孵育2 h，洗滌后顯色，采用Image J 軟件分析圖像。

1.5 免疫熒光法 于建模前及建模后1、3、6、9、14 d檢測大鼠脊髓背角Epac1 陽性細胞數，每個時間點檢測4 只，共24 只；于給藥后1 h 檢測三組大鼠（C組、NS 組和8p-CPT 組）脊髓背角c-Fos 陽性細胞數，每組檢測4 只，共12 只。予10%水合氯醛麻醉大鼠后，給予4%多聚甲醛充分灌注，取腰膨大L4-6脊髓，固定4～6 h 后放入30%蔗糖溶液中脫水，待樣本組織塊沉底后進行冰凍冠狀連續切片。磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌樣本切片后加入抗Epac1 抗體（1∶200）或抗c-Fos 抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜，Tris 緩沖鹽溶液（Tris buffered saline，TBS）洗滌后加入相應二抗，避光常溫孵育2 h，再次洗滌后貼片、甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍片。采用mage-Pro Plus 軟件分析計算脊髓背角Epac1 或c-Fos 陽性細胞數。

1.6 熱刺激縮足潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）檢測法 于建模前1 h、給藥前1 h 及給藥后30 min、1 h、2 h、3 h 檢測三組大鼠TWL，每組檢測8 只，共24 只。參照Hargreaves 法，將大鼠放置在厚3 mm、長15 cm、寬15 cm 的有機玻璃箱中，并在同一時段、室溫、濕度下檢測TWL。采用熱痛敏刺激儀通過恒定的光源刺激強度照射大鼠左后肢足底后外側部。記錄從照射開始到大鼠出現抬腿回避動作之間的時間，每只大鼠連續測定5 次，測量間隔3 min，取其中較平穩3 次的平均值作為大鼠TWL。為防止組織損傷，設置自動切斷時間為25 s。

1.7 統計學方法 應用SPSS 16.0 統計軟件進行數據分析。正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 檢驗，組間均數比較采用雙因素重復測量方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同時間點Epac1、Epac2 相對含量和Epac1 陽性細胞數比較 建模后3、6 d 腰膨大脊髓Epacl 蛋白含量均明顯低于建模前和建模后1 d（P＜0.05）。不同時間點Epac2 蛋白含量差異均無統計學意義（P＞0.05）。建模后3、6、9、14 d 脊髓背角Epac1 陽性細胞數明顯低于建模前（P＜0.05），建模后3、6、9 d 脊髓背角Epac1 陽性細胞數明顯低于建模后1 d（P＜0.05）。見表1。

表1 不同時間點Epac1、Epac2 相對含量和Epac1 陽性細胞數比較（）

表1 不同時間點Epac1、Epac2 相對含量和Epac1 陽性細胞數比較（）

注：Epac 為環磷酸腺苷直接激活的交換蛋白；與建模前比較，aP＜0.05；與建模后1 d 比較，bP＜0.05

2.2 三組大鼠不同時間點TWL 比較 給藥前1 h及給藥后30 min、1 h、2 h、3 h NS 組和8p-CPT 組TWL 均明顯低于C 組（P 均＜0.05），給藥后30 min、1 h 和2 h 8p-CPT 組TWL 均明顯高于NS 組（P 均＜0.05）。見表2。

表2 三組大鼠不同時間點TWL 比較（s，）

表2 三組大鼠不同時間點TWL 比較（s，）

注：C 組不做任何處理；NS 組于建模后鞘內給予生理鹽水；8p-CPT 組于建模后鞘內給予8p-CPT-2'-O-Met-cAMP；TWL 為熱刺激縮足潛伏期；與C 組同期比較，aP＜0.05；與NS 組同期比較，bP＜0.05

2.3 三組大鼠脊髓背角c-Fos 陽性細胞數比較 給藥后1 h NS 組和8p-CPT 組脊髓背角c-Fos 陽性細胞數明顯高于C 組（P＜0.05），8p-CPT 組脊髓背角c-Fos 陽性細胞數明顯低于NS 組（P＜0.05）。見表3。

表3 三組大鼠脊髓背角c-Fos 陽性細胞數比較（個，）

表3 三組大鼠脊髓背角c-Fos 陽性細胞數比較（個，）

注：C 組不做任何處理；NS 組于建模后鞘內給予生理鹽水；8p-CPT 組于建模后鞘內給予8p-CPT-2'-O-Met-cAMP；與C 組比較，aP＜0.05；與NS 組比較，bP＜0.05

3 討論

Epac 蛋白和蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）均為cAMP 下游信號分子，介導多種cAMP 效應，在神經元興奮性[8]、神經遞質釋放[9]、突觸傳遞[10]等方面發揮了重要作用。在外周初級感覺神經元水平，PKA蛋白在炎性痛急性期發揮調節作用，而PKA 和Epac蛋白共同參與介導了慢性疼痛過程，通過對胞內活化的Epac 蛋白有效抑制，可以緩解慢性炎性痛反應[11]。

本研究結果顯示，建模后1 d（炎性痛急性期），L4-6脊髓Epac 蛋白含量和脊髓背角Epac1 陽性細胞數均無明顯變化；建模后3 d（炎性痛亞急性期）腰膨大脊髓Epac1 蛋白含量和脊髓背角Epac1 陽性細胞數均明顯降低，并于建模后6 d（炎性痛慢性期）達到最低值，因此，考慮在此時進行藥物干預治療效果最佳。建模后6 d，脊髓Epac2 蛋白表達無明顯變化，提示參與促進CFA 引起的慢性炎性痛過程的蛋白為Epac1 蛋白而非Epac2 蛋白。本實驗研究選擇于建模后6 d 進一步通過鞘內注射給予Epac 激動劑8p-CPT 進行藥理學干預，結果顯示，8p-CPT 可以明顯減輕CFA 誘發的慢性炎性熱痛敏反應，與鞘內注射NS 前1 h 比較，給藥后30 min、1 h、2 h 和3 h 炎性熱痛敏反應均無明顯變化，表明鞘內注射NS 對實驗結果無明顯影響。給藥后1 h 藥效最強，此時進行脊髓背角神經元活化標記物c-Fos 陽性細胞數檢測，提示8p-CPT 的鎮痛作用可能與其引起的脊髓背角神經元興奮性降低、抑制痛信號傳導有關，這也與前期研究下丘腦室旁核內Epac1 通路下調引起慢性炎性痛過程的結果相一致[5]，但與Singhmar 等[11]研究表明的外周感覺神經元中Epac1 蛋白上調引起慢性炎性痛過程的結果相反，這可能與外周和中樞在慢性炎性痛調節過程中發揮的不同作用有關。

在外周炎癥反應持續刺激下，傷害性感受器敏感性增加，痛覺神經興奮閾值降低，產生的異常動作電位可以通過傷害性有髓Aδ 纖維和無髓C 纖維向中樞傳遞，傷害性傳入纖維首先終止于脊髓背角[12]，同時脊髓背角神經元也接收高級中樞5-羥色胺和去甲腎上腺素等單胺能神經元下行傳入的調節[13]，通過與脊髓背角興奮型或者抑制型中間神經元形成突觸或容積傳遞，整合疼痛信號，經過第一級中轉后繼續發出神經纖維上升1～2 個節段，在白質前聯合處交叉至對側并組成脊髓丘腦束，進一步向高級中樞傳遞痛、溫覺。隨著外周疼痛信號的不斷傳入，脊髓背角疼痛相關的神經遞質或調質，如谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）、P 物質、乙酰膽堿、甘氨酸等分泌調節功能受損[14]，打破局部興奮性和抑制性神經遞質相互作用間的平衡，且局部信號受體或膜蛋白，如GABA 受體、M 膽堿能受體、鉀氯聯合轉運蛋白2 等功能也發生改變[15]，造成肢體對傷害性刺激反應性增強，這可能引起炎性痛從急性向慢性發生轉變，產生慢性痛覺過敏。

綜上所述，CFA 誘導的慢性炎性痛與脊髓背角Epac1 蛋白含量降低、引起局部神經元異常激活、增強外周傷害性刺激應激反應有關，這將為臨床慢性炎性痛的治療提供一定的理論基礎和治療靶點。