不同貯藏年份霍山石斛楓斗質(zhì)量分析

戴亞峰，胡莉，王詩文，張林，縱瑞葉，黃月純，魏剛

（1.九仙尊霍山石斛股份有限公司，安徽六安 237000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

霍山石斛Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng（D.huoshanense）為蘭科石斛屬多年生草本植物，又稱“米斛”，僅分布于安徽省霍山縣及其鄰近地區(qū)，乃石斛中的極品[1]，具有清胃除虛熱、益胃生津、厚腸胃、輕身延年、補(bǔ)虛羸等多種功效[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，霍山石斛具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗肝損傷、增強(qiáng)免疫力和抗白內(nèi)障等藥理作用[3-6]，主要藥理成分包括多糖類、黃酮類、氨基酸、生物堿類及微量元素等[7]，其中多糖類和黃酮類成分是其含量最高的主要活性成分。

霍山石斛楓斗，也稱為“霍斗”“金斗”，是以霍山石斛莖為原料，經(jīng)多道工序制成的彈簧狀干品，形如“龍頭鳳尾”，其工藝被列為“省級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)”[8]。新鮮的石斛不能長久保存，而通過加工成楓斗后石斛就不易霉?fàn)€、蟲蛀和變質(zhì)。同時，由于石斛類植物的莖中黏液成分豐富，加工成楓斗后，有效成分被固化而更加穩(wěn)定，不易分解。霍斗價格昂貴，對不同貯藏年份的霍斗進(jìn)行主要成分分析可保障藥材的質(zhì)量，為其貯藏、開發(fā)、評價等提供參考。本研究對貯藏0、2、4、6年的霍斗進(jìn)行了高效液相色譜（HPLC）特征圖譜分析，同時測定夏佛塔苷、異夏佛塔苷2種主要黃酮類成分含量，并進(jìn)行了多糖HPLC柱前衍生含量測定，分析貯藏時間對霍斗品質(zhì)的影響，研究結(jié)果對于指導(dǎo)企業(yè)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)加工以及科學(xué)貯存霍斗具有重要指導(dǎo)意義，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 儀器與試劑HP1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司，DAD檢測器）；MS-204S電子天平（d=0.1 mg，瑞士Mettler Toledo公司）；MS-105 Du電子天平（d=0.01 mg，瑞士Mettler Toledo公司）；乙腈、甲醇（色譜純，德國Merk公司）；其余試劑均為分析純；水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 試藥夏佛塔苷對照品（批號：111912-201302；純度≥95%），中國藥品生物制品檢定院；異夏佛塔苷（批號：52012-29-0；純度≥95%），法國Extrasynthese公司；對照品D-葡萄糖（批號：110833-201506；純度≥99.9%）、D-甘露糖（批號：140651-201403；純度≥99.6%），中國食品藥品檢定研究院；D-鹽酸氨基葡萄糖（批號：RFS-Y16101912009；純度＞98%）購自成都瑞芬斯公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，批號：A1216009），阿拉丁試劑上海有限公司生產(chǎn)；12批（S1～S12）不同貯藏年份（0、2、4、6年各3批）霍山石斛楓斗均由九仙尊霍山石斛股份有限公司提供，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院黃月純主任中藥師鑒定為霍山石斛的楓斗加工品，見圖1。將霍斗剪碎，打粉，過4號篩（65目）。

圖1 不同貯藏年份霍山石斛楓斗外觀性狀Figure 1 External properties of D.huoshanense Fengdou after different years of storage

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC特征圖譜分析

2.1.1 色譜條件Kromasil 100-5 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。流動相為甲醇+乙腈（A，v/v=1∶1）-0.01 mol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，14%～18%A；20～35 min，18%～22%A；35～45 min，22%～26%A；45～55 min，26%～30% A）。流速0.8 mL/min，柱溫40℃，檢測波長340 nm，進(jìn)樣量10μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末（過4號篩）1 g，精密稱定，加入80%甲醇50 mL，超聲提取1 h；取出，放冷至室溫；濾過，用適量80%甲醇洗滌濾渣；合并濾液，揮干溶劑，殘渣加60%甲醇溶解至5 mL容量瓶中；加60%甲醇定容，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

2.1.3.1 精密度考察 精密吸取同一供試品溶液（S1）10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示，12個共有特征峰的相對保留時間及相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.1%，表明儀器的精密度良好。

2.1.3.2 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液（S1）10μL，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣。結(jié)果顯示，12個共有特征峰的保留時間及相對峰面積的RSD均為1.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.3.3 重復(fù)性考察 取同一樣品（S1）6份，依法制備，進(jìn)樣。結(jié)果顯示，12個共有特征峰的保留時間及相對峰面積的RSD均為2.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 樣品的測定

2.1.4.1 共有峰的標(biāo)定HPLC特征圖譜結(jié)果表明，12批霍山石斛楓斗樣品共標(biāo)定12個共有峰，其中包括藥典規(guī)定的5個特征峰（峰3：夏佛塔苷；峰4：異夏佛塔苷；峰7：芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-（1→2）-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖；峰8：芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-α-L-鼠李糖-（1→2）-β-D-葡萄糖；峰9：芹菜素-6，8-二-C-α-L-阿拉伯糖[9]）。結(jié)果見圖2。其相對保留時間與相對峰面積以峰3（夏佛塔苷）為參照峰計算。結(jié)果見表1。

表1 12批霍山石斛楓斗高效液相色譜（HPLC）特征圖譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積Table 1 Relative retention time and relative peak areas of common peaks in characteristic chromatogram of 12 batches of D.huoshanense Fengdou by HPLC

圖2 12批霍山石斛楓斗高效液相色譜（HPLC）特征圖譜重疊圖Figure 2 Overlapping image of HPLC specific chromatogram of 12 batches of D.huoshanense Fengdou

2.1.4.2 共有峰相似度分析 采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2004A版）軟件進(jìn)行相似度分析，以均值數(shù)法生成對照圖譜，12批樣品與對照圖譜的相似度為0.971～0.997，相似度良好，結(jié)果見表2。

表2 12批霍山石斛楓斗高效液相色譜（HPLC）特征圖譜相似度結(jié)果Table 2 Similarity results of HPLC specific chromatogram of 12 batches of D.huoshanense Fengdou

2.2 夏佛塔苷、異夏佛塔苷含量測定

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項。

2.2.2 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察 同“2.1.3.1～2.1.3.3”項。

2.2.3.2 線性范圍考察 取夏佛塔苷和異夏佛塔苷對照品適量，精密稱定，加60%甲醇分別制成每1 mL含夏佛塔苷28.12μg、異夏佛塔苷25.94μg的對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液各1、2、5、10、15、20、25μL，按擬定色譜條件測定峰面積。以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。夏佛塔苷的回歸方程為Y=1 858.1X-1.855 0，線性范圍為0.028 14～0.703 5μg，r=0.999 9；異夏佛塔苷的回歸方程為Y=1 894.3X-3.019 8，線性范圍為0.025 94～0.648 5μg，r=0.999 9。

2.2.3.3 加樣回收率考察 稱取6份已知含量的霍山石斛楓斗樣品（S1），每份約0.5 g，精密稱定，分別加入一定量的夏佛塔苷、異夏佛塔苷對照品，依法制備。進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算得二者平均回收率分別為98.36%、101.17%，RSD均小于3%。

2.2.4 樣品的測定

2.2.4.1 對照品與樣品圖譜分析 分別取夏佛塔苷、異夏佛塔苷對照品溶液，混合對照品溶液以及供試品溶液（S1），按擬定色譜條件進(jìn)樣分析，得到色譜圖，見圖3。

圖3 夏佛塔苷、異夏佛塔苷對照品及霍山石斛楓斗樣品（S1）高效液相色譜（HPLC）圖譜Figure 3 HPLC chromatogram of xavertaoside，isoxavertaoside controls and samples（S1）

2.2.4.2 樣品含量測定 取供試品溶液，按擬定色譜條件依法進(jìn)樣分析，記錄夏佛塔苷、異夏佛塔苷峰面積，計算含量，結(jié)果見表3。5個主要特征峰相對百分含量見圖4。

表3 12批霍山石斛楓斗夏佛塔苷和異夏佛塔苷含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of the contents of xavertaoside and isoxavertaoside in 12 batches s of D.huoshanense Fengdou

圖4 霍山石斛楓斗5個黃酮成分特征峰相對百分含量圖Figure 4 Relative percentage content of 5 characteristic peaks of flavonoid components from D.huoshanense Fengdou

2.3 D-甘露糖、D-葡萄糖HPLC柱前衍生含量測定

2.3.1 色譜條件Kromasil 100-5 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。流動相為乙腈（A）-0.02 mol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，16% A；5～17 min，16%～19% A；17～30 min，19%～22%A；30～35 min，22%～16%A）。流速為1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長250 nm，進(jìn)樣量10μL。

2.3.2 對照品與供試品溶液的制備 同文獻(xiàn)研究[10]的制備方法。

2.3.3 方法學(xué)考察

2.3.3.1 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察 取供試品溶液（S6），根據(jù)“2.1.3”項下方法，按擬定色譜條件進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，精密度試驗RSD為1.8%，重復(fù)性試驗RSD為2.5%，在0、2、4、8、12、24 h穩(wěn)定性試驗RSD均為2.1%。

2.3.3.2 線性范圍考察 精密稱取D-甘露糖、D-葡萄糖對照品，制成0.037 5、0.075、0.15、0.3、0.75、1.5、2.25、3.0 mg/mL D-甘露糖和D-葡萄糖系列對照溶液。以對照品濃度為橫坐標(biāo)X，D-甘露糖或D-葡萄糖與D-鹽酸氨基葡萄糖內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Am/As）為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果顯示：D-甘露糖的回歸方程為Y=1.003 6X-0.038 0（r=0.999 4），在0.037 5～3.00μg線性關(guān)系良好；D-葡萄糖的回歸方程為Y=0.792 8X+0.172 4（r=0.999 4），在0.037 5～3.00μg線性關(guān)系良好。

2.3.3.3 加樣回收率考察 稱取6份已知含量的霍山石斛楓斗樣品（S6），每份約0.06 g，精密稱定，分別加入一定量的對照品，依法制備，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果計算得D-甘露糖、D-葡萄糖平均回收率分別為101.65%、100.74%，RSD均小于3%。

2.3.4 相對校正因子的計算 取D-甘露糖、D-葡萄糖混合對照品溶液10μL，按擬定的色譜條件，分別測定D-甘露糖、D-葡萄糖、內(nèi)標(biāo)物的峰面積。計算校正因子f=（mi/Ai）/（ms/As），mi、Ai為被測組分的含量與峰面積。ms、As為內(nèi)標(biāo)物的加入量與峰面積，結(jié)果顯示：D-甘露糖、D-葡萄糖的平均相對校正因子分別為0.939 4、0.959 1，RSD分別為2.0%、1.2%。

2.3.5 樣品的測定

2.3.5.1 混合單糖對照品與樣品圖譜分析 分別取混合單糖對照品溶液與供試品溶液（S6），按照“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣10μL，分析得到色譜圖（見圖5）。

2.3.5.2 樣品含量測定及峰面積比值分析 記錄D-甘露糖、D-葡萄糖和內(nèi)標(biāo)物的峰面積，以內(nèi)標(biāo)法計算各樣品中D-甘露糖含量、D-葡萄糖含量，并計算兩者含量之和，以及兩者峰面積的比值（A甘/A葡）。結(jié)果見表4、圖6。

圖6 霍山石斛楓斗中D-甘露糖、D-葡萄糖以及兩糖之和含量測定結(jié)果Figure 6 Determination results of D-mannose and D-glucose contents and their sum in D.huoshanense Fengdou

表4 霍山石斛楓斗中D-甘露糖、D-葡萄糖的含量及其峰面積比值Table 4 Contents and peak area ratio of D-mannose and D-glucose from D.huoshanense Fengdou

3 討論

從外觀性狀看，12批霍山石斛楓斗無明顯差別，大小、色澤一致，表面呈黃綠色，緊湊彈簧狀，環(huán)繞緊密，莖基部和莖梢翹出，形如龍頭和鳳尾，且含水率≤8%?；羯绞狞S酮類成分主要為黃酮碳苷，這類成分的糖基和苷元可能隨著貯存時間的增長更多地結(jié)合而含量升高[11-12]。本研究HPLC特征圖譜分析結(jié)果表明，不同貯藏年份的霍斗黃酮類成分特征峰基本一致，且相似度較高。夏佛塔苷與異夏佛塔苷含量測定結(jié)果為0.051 3～0.091 5 mg/g，含量范圍符合之前對霍山石斛鮮品的測定結(jié)果[13]，且5個特征峰相對百分含量較為一致?；羯绞鷨翁侵饕蒁-甘露糖與D-葡萄糖組成[14]，相比于誤差較大的總多糖含量測定，兩糖含量之和的測定更具有可行性，D-甘露糖與D-葡萄糖含量之和為23.87%～37.19%。此外，從D-甘露糖與D-葡萄糖峰面積之比可以看出，貯存0年和2年的霍斗兩糖比例基本相同，而貯存4年和6年的霍斗甘露糖占比更高，這可能與其鮮品的栽培方式有關(guān)。

從黃酮類成分特征峰及含量測定，以及多糖含量指標(biāo)來看，貯藏6年之內(nèi)的霍斗，其主要黃酮類及多糖成分均較一致，質(zhì)量良好。同時提示在此種栽培技術(shù)下，霍山石斛的遺傳性穩(wěn)定。不同貯藏年限霍斗主要成分含量有一定的差異，這可能與栽培年限、栽培環(huán)境、采收時間等諸多因素影響有關(guān)。此外，可進(jìn)一步從揮發(fā)性成分的變化角度進(jìn)行不同貯藏年份霍斗的質(zhì)量分析。