miRNA-mRNA 雙重表達譜在前列腺癌分子調控機制中的作用

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常見的癌癥之一，也是西方男性癌癥死亡的第2 大原因。有資料顯示

，我國70 歲以上人群前列腺癌的發生率高達25%。早期前列腺癌不易被發現，大多數前列腺癌患者初診時已經發生癌細胞轉移，失去治愈的機會。在過去的幾十年中，雖然前列腺癌的診斷技術已經得到了顯著提高，而且前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）也被認為有助于提高前列腺癌的診斷率，但當前也有很多研究認為應用PSA 診斷前列腺癌并不完全成功。有研究表明，相比PSA，堿性磷酸酶（ALP）在評估治療反應上的準確性更高

。miRNA（microRNA）是由18～25 個核苷酸組成的非編碼RNA，參與基因表達的轉錄后調控

。研究認為

，體液中miRNA 表達差異與前列腺癌患者的預后相關，可能成為評估前列腺癌患者預后的分子標記物。本文通過對前列腺癌的mRNA 和miRNA的雙重表達譜的生物信息學分析，探討miRNA 和mRNA 在前列腺癌中的分子調控機制并構建調控網絡，報道如下。

1 資料與方法

1.1 前列腺癌的miRNA 表達譜數據及差異表達分析通過GEO 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取前列腺癌的miRNA 表達譜數據，數據平臺為GSE8126，該數據中包括60 個前列腺癌組織樣本和15 個正常前列腺組織樣本。通過對數據的預處理（中心化，對數變換和標準化），獲得326 個miRNA的表達值。采用matlab 生物信息工具箱中的

檢驗篩選差異表達的miRNA，定義差異表達的miRNA為：

＜0.05 且FDR＜0.01，其中Fold_change＞1.5 認為該miRNA 是上調的，Fold_change ＜1/1.5 認為該miRNA 是下調的。

上一秒還好得跟一個人似的，下一秒就掐起來，是田朵和小寧的常態。田朵和小寧都是獨生子，在家里被寵慣了，雖然兩個人結婚快兩年了，可是他們的脾氣一點也沒收斂，經常為雞毛蒜皮的小事吵架，吵急了的時候，還會把離婚掛在嘴邊。

1.2 前列腺癌的mRNA 表達譜數據及差異表達分析通過GEO 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取前列腺癌的mRNA 表達譜數據，數據平臺為GSE6956，該數據中包括60 個前列腺癌組織樣本和15 個正常前列腺組織樣本。通過對數據的預處理（中心化，對數變換和標準化），獲得13 787 個mRNA的表達值。差異表達mRNA的篩選標準為

＜0.05且FDR＜0.01；其中Fold_change＞1.5 認為該mRNA是上調的，Fold_change＜1/1.5 認為該mRNA 是下調的。

1.3.2 基于廣義典則相關分析的miRNA-mRNA 調控 采用改進的廣義典則相關分析篩選出所有上調和下調的miRNA 和mRNA，探討miRNA 和mRNA的調控關系并構建調控網絡。提取前10 個miRNA和前20 個mRNA 作為前列腺癌的特征生物標記，采用R 軟件的mixOmics 軟件包（http://r-project.org）進行分析。

2.3 miRNA 和mRNA的調控關系

2.1 miRNA 表達譜數據的差異表達分析 共發現117 個差異表達的miRNA，其中有15 個差異表達的miRNA 是下調的，如miR-521 和miR-527 等；有20個差異表達的miRNA 是上調的，如miR-511 和miR-526a 等。將上調和下調的差異表達的miRNA進行雙向層次聚類，見圖1。

1.3.1 基于Pearson 相關的miRNA-mRNA 反向調控從MicroCosm Targets 數據庫（http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/）下載篩選出的 Fold_change 最大的上調的 miRNA 和Fold_change 最小的下調的miRNA的靶基因，計算它們與靶基因的Person 相關系數并分析這兩個miRNA 和它們的靶基因的反向調控關系。

1.3.3 miRNA-mRNA 網絡構建 基于廣義典則相關分析，確定典則相關系數的cutoff 值并根據cutoff值，保留獲得的miRNA-mRNA 調控關系，根據該調控關系構建相應的調控網絡。網絡中的miRNA 如果調控的mRNA的數目較多，稱為該miRNA 具有較高的度，為網絡中的hub miRNA，認為其是與前列腺癌相關的重要生物標記。

2 結果

經濟增長收斂性是指在封閉的經濟條件下，對于一個有效經濟范圍的不同經濟單位，初期的靜態指標和其經濟增長速度之間存在負相關關系，即落后地區比發達地區有更高的經濟增長率 （劉強，2001）［21］。將其應用于能源領域，β收斂是指某地區能源強度的增長速度與其能源強度的初始水平呈負相關關系，分為絕對收斂和條件收斂兩種。絕對β收斂是假設不同地區具有相同的外部條件，如經濟發展程度、技術水平、產業結構等，隨著時間的推移，所有地區的能源強度都將收斂于相同水平；條件β收斂是將外界因素納入到模型中，探討外界因素對能源強度收斂的影響。因而，本文通過建立條件β收斂的模型來探討產業轉移對能源強度收斂的影響。

2.3.2 基于廣義典則相關的miRNA-mRNA 調控 對于提取出的全部差異表達的上調和下調的miRNAmRNA 雙重表達譜數據集采用改進的廣義典則相關分析，結果顯示，該法可以有效區分前列腺癌樣本和正常人群樣本，見圖3。根據第一主成分的權系數，提取出與前列腺癌相關度最高的前10 個miRNA 和前20 個mRNA，見圖4A、圖4B。在這些提取的miRNA 和mRNA 中，有些miRNA 和mRNA 被已有報道證實是與前列腺癌相關的，如發現MED13L的第一主成分權系數在前列腺癌患者中最高。有研究發現MED 家族的基因，如MED12的體細胞突變會導致前列腺癌的發生

。對于miRNA，其中miR-29b和miR-29b-1*的第一主成分權系數在正常人群中最高。此外，miR-488*的第一主成分權系數在前列腺癌患者中最高。按照典則相關系數的cutoff 為0.9的標準，保留了所有典則相關系數大于0.9的miRNA-mRNA 調控關系，繪制miRNA 和mRNA的調控網絡圖，其中miR-29b 和miR-29b-1*是網絡中度最高的兩個結點（度=21），這兩個miRNAs 在網絡中調控的基因數最多，見圖5。

1.3 miRNA 和mRNA的調控關系

納入標準：既往未行脊柱融合術；全脊柱X線片冠狀面上Cobb角＞ 80°且bending位上柔韌度＜ 30%，或矢狀面上Cobb角＞ 70°；自愿接受本研究治療方案且簽署知情同意書。排除標準：伴有頸椎不穩、寰樞椎脫位等不能耐受牽引的患者；嚴重藥物依賴性疾病、心理疾病、嚴重脊柱外傷或脊髓損傷、心肺功能嚴重障礙等不能耐受治療的患者；其他不適合因素。

2.3.1 基于Pearson 相關的miRNA-mRNA 反向調控Fold_change 最小的下調miRNA 為miR-137，在MicroCosm Targets 數據庫中發現了其對應的1991個靶向基因，其中上調的基因為HOXC4、NPIPL3 和WSB1。miR-137 和HOXC4的相關系數為

=-0.5566，

=2.15E-07；miR-137 和NPIPL3的相關系數為

=-0.7366，

=4.98E-04；miR-137 和WSB1的相關系數為

=-0.7959，

=1.44E-17；miR-137 和這3 個基因呈反向調控關系。Fold_change 最大的上調miRNA為miR-367，在MicroCosm Targets 數據庫中發現其對應的2045 個靶向基因，其中下調的基因分別為MEFA 和TNFAIP6。miR-367 和MEFA的相關系數為

=-0.7840，P=8.99E-17，miR-367 和TNFAIP6的相關系數為

=-0.7627，

=1.85E-15；miR-367 和MEFA 及TNFAIP6 呈反向調控關系。

2.2 mRNA 表達譜數據的差異表達分析 共識別出9054 個差異表達的mRNA，其中有35 個差異表達的mRNA 是下調的，有36 個差異表達的mRNA 是上調的。雙向層次聚類結果見圖2，mRNA 表達譜能夠很好的區分不同組織起源的樣本。

3 討論

前列腺癌是男性生殖系最常見的惡性腫瘤，研究表明分子調控機制在前列腺癌的預后和診斷中有著非常重要的作用。本研究對前列腺癌的mRNA 和miRNA的雙重表達譜進行了生物信息學分析，采用了差異表達分析提取了與前列腺癌相關的上調和下調的miRNA 和mRNA，并通過Pearson 相關分析和廣義典則相關分析探討了miRNA 和mRNA的分子調控機制。廣義典則相關分析可用于特征降維，特征融合和相關分析等。將廣義典則相關分析應用于特征miRNA 和mRNA的提取，其中特別結合了miRNA 和mRNA的靶向失調關系作為預設矩陣，并根據miRNA 或mRNA 在第一個成分的權系數提取與前列腺癌相關的特征miRNA 和特征mRNA。

本病案對患者進行了綜合性治療，尤其對基礎病進行有效干預，患者加用胰島素治療，使血糖維持在相對正常的水平，提高了機體抗感染能力，為我們后續治療提供了保障。

除了對病毒分離培養與鑒定方法之外，還可以采用免疫電鏡法，這種檢測方法擁有簡便、直觀、快速、準確的優點，但是由于檢測過程中需要使用價格昂貴的電鏡設備，所以診斷費用比較高。此種方法不適合進行大規模的診斷。免疫電鏡法就是可以通過電鏡能夠清晰的觀察到病毒結構、形態以及立體結構等特征，然后可以對疾病作出判斷。將患病仔豬的小腸或者病毒細胞培養物用固定液進行固定，然后用機器切成超薄的切片，在電鏡下進行觀察病毒的結構、形態。這種方法能夠有效區別豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒，因為免疫電鏡法不僅可以用已知的豬流行性腹瀉病毒高免血清檢測未知抗體，而且還能夠借助已知的豬流行性腹瀉病毒抗原檢測未知抗體[3]。

本研究發現，MED 家族基因MED13L的第一主成分權系數在前列腺癌患者中最高。有研究發現，在局限性前列腺癌患者的異質性腫瘤病灶中檢測到體細胞腫瘤變異，發現cfDNA 突變負荷與疾病嚴重程度相關。在cfDNA 中發現了體細胞組織的改變，其中就包括MED 家族中MED12的非同義變異

。此外，TRRAP 是本次識別的與前列腺癌高度相關的基因。TRRAP 曾在陰莖鱗狀細胞癌

和卵巢癌中檢測到突變

。在通過外顯子測序及Sanger 測序探索66 個家族中140 例患有前列腺癌的日本患者的生殖系變異研究中，除了已知的易感基因BRCA2 和HOXB13 外，還發現了TRRAP 變體以及BRCA2、HOXB13 和TRRAP的共同變體

。

了解癌癥中miRNA的調控機制對于理解其生理作用以及癌癥相關功能障礙和失調的影響至關重要

。近年來的研究表明，miRNAs的異常表達與前列腺癌的發生、侵襲、轉移及預后密切相關。雖然已經報道了許多miRNAs 可作為前列腺癌治療的新生物標記物，但報告的數據不一致，仍需進一步實驗

。因此，研究前列腺癌相關的miRNA 及其調控的靶向基因對于識別前列腺癌相關的生物標記及這些生物標記在前列腺癌的臨床應用有著十分重要的價值。

本研究發現，miR-29b 與前列腺癌高度關聯，并在miRNA-mRNA 分子調控網絡中調控的基因數最多。目前，已有文獻證實miR-29b 可以阻止前列腺癌的發生和發展。Zhu C等

發現前列腺癌患者腫瘤組織中miR-29b的表達明顯低于癌旁組織，有望成為前列腺癌診斷的新生物標志物。Ivanovic RF等

研究認為，恢復miR-29b 水平的治療可能是控制前列腺癌轉移的有效方案。Sur S等

在瘤內注射模擬miR-29b，顯著抑制了裸鼠前列腺癌異種移植瘤的生長，表明miR-29b 可以作為前列腺癌治療的潛在分子，為未來開發前列腺癌的藥物靶向提供幫助。Vladimir AV等

在年輕男性前列腺癌患者的分子特征研究中發現，miR-29b的表達與老年男性前列腺癌患者顯著不同，這項研究為前列腺癌亞型的分子機制提供了參考。Kato M等

的研究表明，miR-29b 與其他五種miRNA 協同調節促進轉移的基因（LOXL2），揭示了前列腺癌發病機制的新分子機制。此外，miR-488 是本研究中發現的與前列腺癌相關度最高的前10 個miRNA。miR-488 在多種腫瘤中作為抑癌基因發揮作用，如乳腺癌、卵巢癌和結直腸癌等

。Wang J等

研究發現，miR-488 在前列腺癌患者腫瘤組織中的表達低于正常組織，其通過靶向PFKFB3 可以抑制前列腺癌細胞的增殖和糖酵解，因此可能會作為潛在的前列腺癌新的治療靶點。本研究也存在一定的局限性。如數據庫中的前列腺癌相關的miRNA-mRNA 雙重表達譜數據集相對很少，因此不能保證分析結果的穩定性；此外，本研究結果是基于miRNA-mRNA 雙重表達譜數據的生物信息學分析，識別出的特征miRNA 和mRNA 還需要應用分子生物實驗進行驗證。

綜上所述，MED 家族基因MED13L的第一主成分權系數在前列腺癌患者中最高，TRRAP 是與前列腺癌高度相關的基因；miR-29b 與前列腺癌高度關聯，并在miRNA-mRNA 分子調控網絡中調控的基因數最多，而miR-488 是與前列腺癌相關度最高的前10 個miRNA。

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