黃芩苷鎂對脂多糖聯合D-氨基半乳糖致急性肝損傷大鼠炎癥因子的影響

肝臟是人體內物質代謝和起生物轉化作用的重要器官，急性肝損傷（acute hepatic injury，AHI）是指由于酒精、病毒、化學藥物等一種或多種因素導致的短時間內肝功能急劇損傷，損傷嚴重還可能導致肝功能衰竭伴有很多并發癥，具有很高的致死率

。對于治療肝損傷，目前國內外并沒有合適的藥物，因此尋找在臨床上能夠有效治療肝損傷的藥物成為研究熱點。中藥黃芩性苦寒，具有清熱瀉火、燥濕解毒之效，可以治療黃疸

。黃芩主要成分為黃芩苷，具有抗炎、抗氧化等藥理作用。據文獻報道，黃芩苷對非酒精性脂肪性肝炎具有一定的治療作用

，還對對乙酰氨基酚誘導的急性肝損傷小鼠具有保護作用

。由于水溶性差的特點，致使黃芩苷臨床應用受到限制，而水溶性及穩定性極好的黃芩苷鎂解決了這一問題

。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）聯合D-氨基半乳糖（D-Galactosamine，D-GalN）制備急性肝損傷模型是國內外公認的經典方法

，其誘導的急性肝損傷病理變化與臨床乙肝病理變化類似

，主要是由炎癥介導的免疫性肝損傷。當中毒、感染等內外因素刺激下，免疫調節作用失控，二者比例失衡，活化的免疫細胞分泌大量炎癥因子，就可能會引起免疫功能紊亂，進而造成肝細胞損傷

。有報道D-GalN 致急性肝衰竭大鼠模型中存在Th 細胞分泌的炎癥因子失衡

，在肝損傷的過程中IL-6、IFN-γ、TNF-α 等Th1 類細胞因子發揮主要作用

。因此，本研究擬通過檢測炎癥因子水平來探究黃芩苷鎂尾靜脈給藥對LPS/D-GalN 誘導急性肝損傷大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 54 只SPF 級雄性SD 大鼠購于維通利華，許可證號SCXK（京）2016-0006，5 周齡，重（170±10）g，本研究已通過我校倫理委員會審批，批準文號：CDMULAC-20181219-006。大鼠飼養于SPF級環境。試劑及儀器：LPS、D-GalN（Sigma-Aldrich），異甘草酸鎂（正大天晴藥業），黃芩苷鎂（純度為85%，由承德醫學院劉翠哲教授課題組提供），紅帽負壓液體采集管（不抗凝）國產（Bebolabs），大鼠IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α 試劑盒（聯科生物），SIM-F124 制冰機（日本SANYO 公司），PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）（TaKaRa），DEPC處理水（DNase、RNase free）（Beyotime），普通RIPA（組織/細胞）裂解液（附PMSF 1.5 ml）（Solarbio），引物（TaKaRa），PCR 儀（BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 大鼠適應性飼養1 周，按照隨機數字表法分為模型組、正常組、黃芩苷鎂（BAMg）高、中、低劑量組（100、50、25 mg/kg），異甘草酸鎂組（MgIG）（18 mg/kg），每組9 只。給藥組尾靜脈注射相應濃度的藥物連續7 d，1 次/d，模型及正常組以相同方法給予等量生理鹽水。根據前期實驗結果，確定造模條件為20 μg/kg LPS 聯合400 mg/kg D-GalN，于12 h 后取材

。

1.2.2 ELISA 法檢測血清炎癥因子 取材，大鼠血液離心后得到血清置于冰上備用；在標準品孔中，分別加入呈比例稀釋的標準品100 μl 作為標準曲線，加100 μl 標準品稀釋液于空白孔內作為空白對照，在樣本孔中，加入樣本溶液20 μl、1×檢測緩沖液80 μl；然后所有孔加入稀釋好的檢測抗體溶液50 μl；37 ℃孵育1.5 h；沖洗6 次；加辣根酶標記的鏈霉親和素100 μl/孔；37 ℃孵育30 min；沖洗6 次；避光加入顯色底物100 μl/孔，避光室溫孵育30 min；加終止液100 μl/孔；30 min 內，上機檢測450 nm 條件下的OD 值；處理數據，檢測血清樣本中IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 含量。

2 結果

黃芩苷鎂是黃芩苷與鎂離子耦合形成的水溶性化合物，它是黃芩苷在植物中的主要存在形式

。有文獻報告黃芩苷在腎損傷、心肌損傷、脊髓損傷、肺損傷等方面均有一定的治療作用

。課題組前期研究發現BA-Mg 可改善CCl

誘發的大鼠急性肝損傷

，其可能通過Nrf2/ARE 信號通路抑制氧化應激反應發揮保護作用

。有研究報道了黃芩苷鎂對急性肺損傷小鼠就有一定保護作用

。因此本研究通過BA-Mg 預處理大鼠1 周后，進行LPS/D-GalN 誘導急性肝損傷

，研究BA-Mg 對LPS/D-GalN 誘導急性肝損傷是否有保護作用。

3 討論

模型組血清IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 水平高于正常組，差異有統計學意義（

＜0.05）；黃芩苷鎂高、中劑量組、異甘草酸鎂組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ水平低于模型組，差異有統計學意義（

＜0.05）；黃芩苷鎂低劑量組血清IFN-γ 水平低于模型組，差異有統計學意義（

＜0.05）；黃芩苷鎂低劑量組血清IL-6、IL-1β、TNF-α 水平與模型組比較，差異無統計學意義（

＞0.05）；黃芩苷鎂中、低劑量組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ 水平高于異甘草酸鎂組，差異有統計學意義（

＜0.05）；黃芩苷鎂高劑量組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ 水平與異甘草酸鎂組比較，差異無統計學意義（

＞0.05）；黃芩苷鎂高、中、低劑量組血清TNF-α水平與異甘草酸鎂組比較，差異無統計學意義（

＞0.05），見表1。

綜上所述，融合生產在技術上是可行的，雖然短期內還不能見效，但從發展的角度來看，融合生產相對常規生產具有不可比擬的優勢，同時也將發揮更大作用。

免疫應答是機體免疫系統識別并清除“非己”物質的整個過程，需要T、B 細胞及多種固有免疫細胞相互協調、共同作用完成

。T 細胞來源于骨髓造血干細胞，在胸腺發育成熟后定居在外周淋巴器官中的胸腺依賴區，當受到某些特定的抗原刺激后就會被激活、增殖，并分化為發揮效應的T 細胞和具有記憶作用的T 細胞，通過淋巴細胞再循環周游全身發揮免疫調節和細胞免疫功能

。依據T 細胞在免疫應答中的功能，將其分為輔助性T 細胞（Th 細胞）、細胞毒性T 細胞（Tc 細胞）和調節性T 細胞（Treg 細胞）。Th 細胞主要分為Th1、Th2 細胞，其中Th1 細胞活化分泌IL-1、IL-2、IFN-γ、TNF-α 等因子，Th2 細胞活化分泌IL-4、IL-6、IL-10 等因子。正常生理狀態下，Th1/Th2 細胞處于動態平衡，調節機體正常免疫應答，在肝損傷狀態下導致二者比例失衡，促炎因子大量分泌，進而可能會引起免疫功能紊亂

。由此，實驗研究檢測了大鼠血清中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 含量。

中醫講究辨證施治，而不是西醫的辨病，西醫師對中醫不甚了解，只能做到辨病，開出的中成藥方很大部分藥不對證。中藥的使用應該咨詢中醫師。

中國石油大學勝利學院是由國家教育部批準設立，教育部直屬高校中國石油大學（華東）和國家特大型企業勝利石油管理局合作舉辦的按新的辦學模式和運行機制運作的全日制普通本科高等院校，是山東省首家由重點大學申辦的規范化獨立學院。

本研究發現，AHI 大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 水平高于正常組（

＜0.05），與文獻報道相一致

，提示LPS/D-GalN 誘導的AHI 過程中，可能使Th1 細胞過度活化，大量分泌IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 等因子，進而導致炎癥反應。黃芩苷鎂高、中、低劑量組可以降低LPS 聯合D-GalN 致急性肝損傷大鼠血清中IL-6、IL-1β、IFN-γ的水平，其中以黃芩苷鎂高、中劑量組較為突出（

＜0.05）。黃芩苷鎂高、中、低劑量組血清中TNF-α 水平有下降的趨勢，與模型組比較，差異無統計學意義（

＞0.05），提示TNF-α 可能并不是BA-Mg 影響的主要因子。因此，BA-Mg 可能通過抑制Th1 細胞的過度活化，進而抑制分泌促炎因子，發揮抗炎作用。黃芩苷鎂高劑量組血清炎癥因子IL-6、IL-1β、IFN-γ 水平與異甘草酸鎂組比較，差異無統計學意義（

＞0.05），黃芩苷鎂中、低劑量組血清炎癥因子IL-6、IL-1β、IFN-γ水平較異甘草酸鎂組高（

＜0.05），提示高濃度BA-Mg 可能與MgIG的抗炎效果一致。

綜上所述，LPS 聯合D-氨基半乳糖可造成急性肝損傷，釋放大量炎癥因子。基于前期AHI 模型建立的條件，黃芩苷鎂可以通過抑制炎癥因子產生來發揮保肝作用，但黃芩苷鎂是否通過影響Th1、Th2細胞增殖來抑制炎癥因子產生，有待進一步研究。

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