基于高通量測序的禁牧對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

朱 怡,吳永波,*,安玉亭

1 南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院,南京 210037 2 江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,南京 210037 3 鹽城市麋鹿研究所,鹽城 224136

麋鹿(Elaphurusdavidianus)是一種原產(chǎn)于我國的大型食草動物,為國家一級保護動物[1]。江蘇大豐麋鹿國家級自然保護區(qū)(以下稱保護區(qū))的麋鹿數(shù)量從1986年的39頭發(fā)展到2020年的5681頭,每頭麋鹿占有的生境面積遠少于保護區(qū)制定的管理方案。麋鹿種群數(shù)量的急劇增加,導致食物匱乏,保護區(qū)內(nèi)環(huán)境壓力上升,圈養(yǎng)區(qū)地表向裸地演變,擴大野放規(guī)模成為保護區(qū)的解決方式。動物各項活動均依托于環(huán)境,進而對環(huán)境產(chǎn)生一定影響[2]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,直接參與土壤中的物質(zhì)分解和養(yǎng)分循環(huán)過程。Chen等[3]認為,土壤微生物多樣性與植物生長情況有關(guān)。高通量測序具有效率高,結(jié)果精確和成本相對低廉的優(yōu)點,逐步成為微生物群落研究的主流技術(shù)。目前高通量測序已被廣泛運用于退耕還林[4]、作物定植年限與種植方式[5—6]以及土地管理方式[7—8]等方面對土壤微生物群落的影響。多年放牧影響了土壤微生物多樣性[9],圍欄封育是恢復放牧地土壤環(huán)境的措施之一。Fenetahun等[10]在博拉納地區(qū)研究圍封對草地環(huán)境的影響中發(fā)現(xiàn),短期圍封就可實現(xiàn)草地承載力的大幅提升。張勝男等[11]分析了短期封育和自由放牧對科爾沁沙地榆樹疏林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,發(fā)現(xiàn)封育后土壤細菌群落轉(zhuǎn)變?yōu)榭焖偕L型細菌為主導。斯貴才等[12]在圍欄封育對受損草地的修復研究中證明,圍欄封育有助于提高土壤水溶性有機碳水平,利于土壤微生物生長,以及土壤生態(tài)功能的恢復。

多年的麋鹿干擾為保護區(qū)環(huán)境帶來壓力,土壤出現(xiàn)退化趨勢[13],保護區(qū)需制定相應的恢復方案以修復麋鹿生境。本文以江蘇大豐麋鹿國家級自然保護區(qū)第一核心區(qū)內(nèi)禁牧點和補飼點土壤為研究對象,利用高通量測序,結(jié)合土壤理化性質(zhì)分析禁牧點和補飼點土壤細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)差異及其環(huán)境影響因子,探究禁牧對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,研究可為保護區(qū)制定麋鹿生境恢復方案提供參考。

1 研究區(qū)概況

江蘇大豐麋鹿國家級自然保護區(qū)地處北緯32°59′—33°03′,東經(jīng)120°47′—120°53′,總面積為2677hm2,分為核心區(qū)、緩沖區(qū)和實驗區(qū)。核心區(qū)下包括第一核心區(qū)(479 hm2)、第二核心區(qū)(578 hm2)和第三核心區(qū)(1620 hm2)三部分。區(qū)內(nèi)整體地勢平坦,平均海拔為2m[14],土質(zhì)為粉砂質(zhì)。屬于海洋和季風氣候的過渡型氣候,夏季高溫多雨,冬季低溫少雨,夏秋季多臺風,為全年的降水高峰期。常年無霜期299d,日照2325.4h,平均氣溫13.7—14.5℃,年平均降水量980-1100mm[15]。

2 研究方法

2.1 樣品采集

采樣于2020年10月在保護區(qū)第一核心區(qū)內(nèi)進行。第一核心區(qū)為圈養(yǎng)區(qū),部分區(qū)域地表已演變?yōu)槁愕亍＠锰阌∶芏群图S便遺留量劃分麋鹿干擾強度[16],蹄印密度和糞便遺留量越大,代表麋鹿干擾強度越大。選取6個面積約為2m2的禁牧點(均位于第一核心區(qū)西南角)和距離禁牧點最近的1個全年使用的補飼點,采集0-20cm土壤,并記錄每個采樣點坐標及其優(yōu)勢植物種類(表1)。選取的補飼點地表裸露,無植被覆蓋,每日進行兩次人工補飼；6個禁牧點均建于2016年,外圍以不銹鋼圍網(wǎng)呈三角形圍繞,建成前一直有麋鹿活動。在每個禁牧點內(nèi)劃定1個1 m×1 m的樣方,按五點取樣法采集土壤并均勻混合,標記為(Inactive area, IA)；在補飼點劃定6個1 m×1 m的樣方(每個樣方間隔10 m),按五點取樣法采集土壤并均勻混合,標記為(Active area, AA),共取得樣品12份。將每份樣品等分為2袋,一袋帶回實驗室風干,用于土壤理化性質(zhì)測定；一袋保存于-80℃超低溫冰箱,用于土壤微生物群落高通量測序。

2.2 土壤微生物DNA提取擴增與測序

采用FastDNA? SPIN Kit for Soil試劑盒 (FastDNA? SPIN Kit for Soil, Norcross, MP, USA)抽提樣品總脫氧核糖核酸(DNA),DNA濃度和純度檢測利用NanoDrop2000進行,提取的DNA質(zhì)量利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；細菌和真菌的PCR引物分別為： 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)、806R (5′-GGACTA CHVGGGTWTCTAA T-3′)[17]和ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、ITS2R(5′-GCTGCGTTCT TCATCGATGC-3′)[18]。細菌的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增體系為20 μL: 5×FastPfu Buffer 4 μL; 2.5 mM dNTPs 2 μL; 正向引物(5μM) 0.8 μL; 反向引物(5μM) 0.8 μL; Fast Pfu聚合酶0.4 μL; BSA 0.2 μL; Template DNA 10 ng；補ddH2O至20 μL。真菌的PCR擴增體系為20 μL: 10× Buffer 2 μL; 2.5 mM dNTPs 2 μL; 正向引物(5 μM) 0.8 μL; 反向引物(5 μM) 0.8 μL; rTaq聚合酶 0.2 μL; BSA 0.2 μL; Template DNA 10 ng；補ddH2O至20 μL。擴增程序如下：95℃ 預變性3min,27個(細菌)/35個(真菌)循環(huán)(95℃ 變性30s,55℃ 退火30s, 72℃ 延伸45s),最后72℃延伸 10min,10℃終止反應,使用的PCR儀為ABI GeneAmp? 9700型。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,選擇主帶為500—750bp之間的條帶,使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)回收PCR產(chǎn)物。回收后的產(chǎn)物交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)檢驗合格后進行高通量測序。

表1 禁牧點與補飼點采樣信息

2.3 土壤理化性質(zhì)測定

土壤理化性質(zhì)測定方法參考《土壤農(nóng)化分析》(第三版)[19]。土壤樣品風干后研磨過篩,土壤容重采用環(huán)刀法；土壤pH采用電極法(水土比為5∶1)；土壤含水率采用烘干法；土壤有機碳采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法；土壤水解性氮采用堿解擴散法；土壤有效磷采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；土壤速效鉀采用NH4OAc浸提-火焰光度法。

2.4 數(shù)據(jù)處理

土壤理化性質(zhì)數(shù)據(jù)在Excel2016中匯總,SPSS 22.0進行顯著性分析。高通量測序數(shù)據(jù)分析均在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供的在線分析平臺上完成。

3 結(jié)果分析

3.1 禁牧對土壤理化性質(zhì)的影響

土壤理化性質(zhì)測定結(jié)果如表2。禁牧點土壤容重低于補飼點,土壤含水率為30.13%,補飼點土壤含水率為19.06%。禁牧點土壤有機碳顯著高于補飼點(P<0.05),補飼點土壤水解性氮、土壤有效磷和土壤速效鉀含量均顯著高于禁牧點(P<0.05)。土壤pH在禁牧點和補飼點內(nèi)差異不顯著。

表2 禁牧點與補飼點的土壤理化性質(zhì)

3.2 測序結(jié)果分析

以97%序列相似度水平為條件,對序列進行質(zhì)控和過濾,得到細菌和真菌的可操作分類單元(OUT)數(shù)分別為5792、955,細菌多于真菌。如圖1所示,細菌和真菌的稀釋曲線隨著取樣數(shù)的增加已趨于平緩,表明加大取樣數(shù)出現(xiàn)新的類群可能性小,測序結(jié)果可反映禁牧點和補飼點土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的實際情況。此外,禁牧點中檢出的細菌和真菌OTU數(shù)高于補飼點。

圖1 禁牧點與補飼點土壤細菌和真菌稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of soil bacteria and fungi for inactive areas and active areasIA1為1號禁牧點樣品;AA1為1號補飼點樣品,以此類推;OTU: 可操作分類單元Operational taxonomic units

3.3 禁牧對土壤微生物群落多樣性指數(shù)的影響

表3為禁牧點和補飼點土壤細菌和真菌群落的多樣性指數(shù)。由表可知,細菌和真菌文庫的覆蓋率均大于98%,覆蓋率較高。禁牧點Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均高于補飼點,Simpson指數(shù)低于補飼點,但無顯著差異。

表3 禁牧點與補飼點土壤微生物群落多樣性指數(shù)

3.4 禁牧對土壤微生物群落組成的影響

3.4.1土壤細菌群落組成

圖2為門水平土壤細菌群落組成,除相對豐度小于1%的類群外,共得到15個類群。其中相對豐度前5位的細菌門為變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、放線菌門(Actinobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes)。變形菌門的相對豐度在禁牧點和補飼點內(nèi)均大于25%,為優(yōu)勢細菌門。禁牧點變形菌門的相對豐度為32%,高于補飼點4.49%。禁牧點綠彎菌門的相對豐度比補飼點低4.81%,酸桿菌門和放線菌門相對豐度高于補飼點,差值為0.63%和6.67%。厚壁菌門的相對豐度在禁牧點內(nèi)為6.12%,低于補飼點4.48%。

圖2 禁牧點與補飼點土壤細菌門水平群落組成Fig.2 Composition of soil bacterial phylum level communities at inactive areas and active areas

圖3為綱水平土壤細菌群落組成,除相對豐度小于1%的類群外,共得到23個類群。相對豐度前5位的細菌綱分別屬于變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和厚壁菌門,以上類群在禁牧點和補飼點內(nèi)的相對豐度之和均大于50%。α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)在禁牧點和補飼點內(nèi)的相對豐度均大于15%,為優(yōu)勢細菌綱；禁牧點內(nèi)γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)的相對豐度為14.88%,高于補飼點7.91%；厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、Vicinamibacteria綱和芽孢桿菌綱(Bacilli)的相對豐度在禁牧點內(nèi)均低于補飼點。

圖3 禁牧點與補飼點土壤細菌綱水平群落組成Fig.3 Composition of soil bacterial class level communities at inactive areas and active areas

3.4.2土壤真菌群落組成

圖4為門水平土壤真菌群落組成,結(jié)果中檢出未分類真菌,禁牧點中未分類真菌檢出比例高于補飼點。除未分類真菌外,以子囊菌門(Ascomycota)的相對豐度最高,且大于50%,為真菌優(yōu)勢門。禁牧點內(nèi)子囊菌門相對豐度為57.93%,低于補飼點15%；禁牧點內(nèi)擔子菌門(Basidiomycota)相對豐度高于補飼點,差值為7.25%；禁牧點和補飼點中被孢霉門(Mortierellomycota)相對豐度差值小于1%。

圖5為綱水平土壤真菌群落組成。除某未分類真菌外,相對豐度前5位的真菌綱分別屬于子囊菌門、擔子菌門和被孢霉門。對比補飼點,禁牧點糞殼菌綱(Sordariomycetes)相對豐度下降,下降幅度為19.08%。傘菌綱(Agaricomycetes)在禁牧點內(nèi)的相對豐度高于補飼點7.31%。被孢霉綱(Mortierellomycetes)相對豐度在禁牧點和補飼點內(nèi)的差值小于1%。禁牧點中散囊菌綱(Eurotiomycetes)的相對豐度為6.77%,高于補飼點6.60%。

3.5 土壤微生物群落多樣性差異分析

采用Bray-curtis距離對禁牧點和補飼點土壤微生物群落多樣性差異進行分析,結(jié)果如圖6所示。細菌群落中,各補飼點樣品距離均小于0.50,表明補飼點內(nèi)部土壤細菌群落多樣性差異較小；各禁牧點樣品距離均大于0.50,表明不同禁牧點土壤細菌群落多樣性差異較大。對比禁牧點和補飼點,除IA1外,各樣品距離均大于0.50,表明禁牧點和補飼點土壤細菌群落多樣性差異較大。真菌群落中,任意兩個樣品的距離均大于0.60,表明禁牧點和補飼點土壤真菌群落多樣性相似性較小。

圖4 禁牧點與補飼點土壤真菌門水平群落組成 Fig.4 Composition of soil fungal phylum level communities at inactive areas and active areas

圖5 禁牧點與補飼點土壤真菌綱水平群落組成 Fig.5 Composition of soil fungal class level communities at inactive areas and active areas

圖6 禁牧點與補飼點土壤細菌和真菌群落多樣性差異分析熱圖Fig.6 Heat map of the difference in diversity of soil bacterial and fungal communities between inactive areas and active areas圖中不同顏色的色塊表示樣品距離,藍色越深表示樣品距離越小,相似性越大；紅色越深表示樣品距離越大,相似性越小

3.6 土壤微生物群落與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

圖7為細菌和真菌群落與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系。冗余分析(RDA)分別解釋了細菌和真菌群落45.26%和52.90%的總方差。在測定的土壤理化性質(zhì)中,土壤pH(P=0.14)和水解性氮(P=0.09)對細菌群落影響較大,pH(P=0.10)和有效磷(P=0. 30)是影響真菌群落最主要的土壤環(huán)境因子。總體來說,細菌受土壤環(huán)境因子的影響大于真菌,土壤pH是影響細菌和真菌群落最主要的土壤環(huán)境因子。

圖7 土壤理化性質(zhì)與細菌和真菌群落的冗余分析Fig.7 Redundancy analysis of soil physicochemical properties with bacterial and fungal communitiesBD:容重 Bulk density；SMC：含水率 Soil moisture content；pH：氫離子濃度指數(shù) Hydrogen ion concentration；SOC：有機碳 Soil organic carbon；AN：水解性氮 Available nitrogen；AP：有效磷 Available phosphorus；AK：速效鉀 Available potassium

4 討論

4.1 禁牧點與補飼點土壤微生物群落結(jié)構(gòu)

本文研究發(fā)現(xiàn),禁牧點內(nèi)細菌和真菌群落多樣性和豐度均優(yōu)于補飼點,但無顯著差異,與鄭佳華等[20]的研究結(jié)果一致。而Zhou等[21]發(fā)現(xiàn),未放牧地土壤細菌多樣性顯著低于中度放牧地和輕度放牧地,這意味著禁牧可能并不是導致土壤微生物多樣性變化的主要因素。

禁牧改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu),與韋應莉等[22]的研究結(jié)果一致。禁牧點和補飼點中檢出的細菌OTU數(shù)多于真菌,細菌數(shù)量占優(yōu)勢,這與黃明勇等[23]在天津濱海鹽堿土地區(qū)的研究結(jié)果一致。細菌群落中相對豐度較高的門為變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、放線菌門和厚壁菌門,類似于已有土壤微生物群落組成的研究結(jié)果[24—26]。圍網(wǎng)圍封阻擋麋鹿進入禁牧點,禁牧點內(nèi)植被凋落物堆積,植被覆蓋率高于80%,地表光照強度降低。綠彎菌門包含可利用光照的菌種[27],光照強度的下降,一定程度上使綠彎菌門相對豐度下降。本文研究結(jié)果中禁牧造成酸桿菌門和放線菌門相對豐度有不同程度的上升,放線菌門相對豐度的上升幅度高于酸桿菌門。酸桿菌門為貧營養(yǎng)型細菌[28],可適應較惡劣的土壤環(huán)境,其中部分菌種和放線菌門的部分菌種可利用纖維素[29—30]。禁牧點內(nèi)植物殘體較多,大量纖維素待分解,為可利用纖維素的酸桿菌門和放線菌門細菌創(chuàng)造有利環(huán)境。

本文研究結(jié)果中禁牧點和補飼點子囊菌門的相對豐度均大于50%,為優(yōu)勢真菌門。目前已知98%的陸生真菌屬子囊菌門和擔子菌門,且子囊菌門下真菌種數(shù)多于擔子菌門[31],表明在一個樣本中檢出的真菌屬子囊菌門的概率高于擔子菌門。禁牧造成糞殼菌綱相對豐度下降,散囊菌綱的相對豐度上升。散囊菌綱和糞殼菌綱同屬子囊菌門,包含多種腐生型真菌[32],兩者可能會存在競爭關(guān)系,這有待進一步探討。禁牧點真菌群落多樣性的相似性低于補飼點,考慮到不同禁牧點優(yōu)勢植物種類并不完全一致,表明真菌受植被種類的影響較大,與已有研究結(jié)果類似[33]。

4.2 土壤微生物群落與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

RDA分析中,土壤pH對細菌和真菌群落的影響較大,但未達到顯著,可能是因為禁牧點和補飼點土壤pH差異較小。土壤pH與多數(shù)禁牧點和補飼點的細菌和真菌群落呈負相關(guān),保護區(qū)土壤pH超出多數(shù)細菌和真菌生長的適宜pH范圍,不利于多數(shù)細菌和真菌的生長。水解性氮對土壤細菌群落的影響僅次于土壤pH,且與多數(shù)補飼點土壤細菌群落呈正相關(guān)。補飼點內(nèi)高強度麋鹿活動帶來大量麋鹿糞便,糞便中的氮素可為土壤細菌生長提供氮源[34],從而促進細菌生長。與土壤pH相反,土壤有效磷與多數(shù)樣點的真菌群落呈正相關(guān),可能與真菌參與土壤磷轉(zhuǎn)化,增加土壤磷的有效性有關(guān)[35]。

有研究表明,土壤微生物群落具有季節(jié)差異[36],后續(xù)可以考慮分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)變化狀況,以全面了解禁牧對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。

5 結(jié)論

研究表明,禁牧顯著影響土壤理化性質(zhì),改變了土壤微生物群落多樣性。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)中,細菌的優(yōu)勢菌門為變形菌門,真菌的優(yōu)勢菌門為子囊菌門。禁牧在門水平上提高了變形菌門、放線菌門和擔子菌門的相對豐度,降低了綠彎菌門、厚壁菌門和子囊菌門的相對豐度,禁牧點與補飼點土壤微生物群落多樣性的相似性較低。RDA分析中,細菌受土壤環(huán)境因子的影響大于真菌,其中土壤pH是影響細菌和真菌群落最大的環(huán)境因子。本文揭示了禁牧對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,可為保護區(qū)制定麋鹿生境恢復方案提供參考。