突變T.fusca角質(zhì)酶對(duì)滌綸織物表面水解作用研究

韓瑞娟, 傅佳佳, 王艷萍, 孟超然, Artur Cavaco-paulo, 王鴻博, 高衛(wèi)東

(1.江南大學(xué) 紡織科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫 214122; 2.米尼奧大學(xué) 生物工程中心,葡萄牙 布拉加 4710-057)

滌綸作為被廣泛使用的合成纖維之一,具有許多優(yōu)良的特性,如彈性模量高、強(qiáng)度高、良好的保形性等[1]。滌綸結(jié)構(gòu)致密且大分子鏈中缺乏反應(yīng)性基團(tuán),導(dǎo)致其染色易出現(xiàn)色淀,織物吸濕性差,穿著悶熱,影響了滌綸織物的美觀性和服用舒適性[2]。為了解決上述問(wèn)題,許多學(xué)者進(jìn)行了大量的研究工作。目前,滌綸織物的親水改性可以在各個(gè)工序中進(jìn)行。如在紡絲過(guò)程中可以采用復(fù)合材料或者多孔化等方法,而表面處理過(guò)程中可以通過(guò)接枝、親水性整理劑、酶改性等。前者對(duì)設(shè)備和工藝要求較高,成本費(fèi)用高,后者相對(duì)簡(jiǎn)單,操作方便,是目前主流的改性方法[3]。

在眾多的表面處理方法中,生物酶反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境友好,通過(guò)水解滌綸的酯鍵可改善織物的疏水性[4]。酶法處理與傳統(tǒng)堿減量改性法相比,減少了織物的質(zhì)量損失,保留了織物的強(qiáng)度[5];與等離子體改性法相比,所需能耗更低和生成的表面基團(tuán)穩(wěn)定性更好,滿足當(dāng)前碳中和、碳達(dá)峰目標(biāo)的要求。因此,利用生物酶改善滌綸織物的潤(rùn)濕性具有較好的發(fā)展前景[6]。

近年來(lái),諸多研究報(bào)道了使用酶改性滌綸織物,主要包括脂肪酶、角質(zhì)酶、PETase等。脂肪酶具有的“蓋子”結(jié)構(gòu)覆蓋了酶的活性位點(diǎn),需要油水界面活化幫助底物與催化中心的結(jié)合,改性效果較差[7]。PETase是Yoshida從Ideonella sakaiensis 201-F6中分離出的一種特殊水解酶,目前對(duì)PETase的研究都集中在提高穩(wěn)定性、活性及降解聚酯類塑料的機(jī)制上面,用于水解高結(jié)晶度的滌綸織物仍然缺乏深入研究[8]。角質(zhì)酶的催化中心暴露于溶劑之中,不存在“蓋子”結(jié)構(gòu),有助于酶識(shí)別聚合物底物。相較于脂肪酶,角質(zhì)酶及其同系物對(duì)滌綸表現(xiàn)出更好的應(yīng)用前景[9]。但與化學(xué)改性相比,使用角質(zhì)酶改性滌綸織物仍然存在著改性時(shí)間長(zhǎng)、水解產(chǎn)物少、改性效果差的缺點(diǎn),如Nimchua[10]報(bào)道的茄病鐮刀菌DSM 62420在168 h內(nèi)催化滌綸水解僅可得到10 μg/mL的水解產(chǎn)物,而尖孢鐮刀菌也只得到18 μg/mL的對(duì)苯二甲酸。由此可見,縮短反應(yīng)時(shí)間、提升改性效果是當(dāng)前新的研究方向。

本研究將熱穩(wěn)定性能優(yōu)異的突變Thermobifidafusca(T.fusca)角質(zhì)酶應(yīng)用于滌綸織物改性,探究了反應(yīng)條件(酶質(zhì)量濃度、處理時(shí)間、溫度、pH值)、表面活性劑和金屬離子等對(duì)滌綸水解產(chǎn)率的影響,并表征改性前后滌綸織物的表面形貌與潤(rùn)濕性能。

1 試 驗(yàn)

1.1 材 料

純滌綸織物(吳江市中鵬紡織有限公司),突變T.fusca角質(zhì)酶(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室),對(duì)硝基苯丁酸酯(西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司),對(duì)苯二甲酸、無(wú)水乙醇、氯化鈣、十二烷基硫酸鈉、亞甲基藍(lán)、碳酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 角質(zhì)酶活性測(cè)量

酶活測(cè)定采用連續(xù)分光光度法[10]。反應(yīng)液的總體積是1.5 mL,其中包括30 μL的突變T.fusca角質(zhì)酶和1 440 μL的pH 8的Tris-HCl緩沖液及30 μL的對(duì)硝基苯丁酸酯底物,將反應(yīng)液于60 ℃下反應(yīng)1 min后,在波長(zhǎng)405 nm處記錄對(duì)硝基酚的生成速率。酶活定義:每分鐘催化對(duì)硝基苯丁酸酯水解生成1 μmol對(duì)硝基苯酚的酶量,即為一個(gè)酶活力單位。

1.2.2 滌綸織物精煉處理與角質(zhì)酶處理

將滌綸織物置于5 g/L肥皂、4 g/L的碳酸鈉溶液中進(jìn)行皂洗30 min以去除漿料和雜質(zhì),然后用去離子水反復(fù)沖洗,在105 ℃的烘箱中烘干備用。

將精煉后的織物按照1︰40的浴比放入緩沖液中,探究酶質(zhì)量濃度(10～30 U/g),pH值(7～9)、溫度(50～70 ℃)、反應(yīng)時(shí)間(12～72 h)和CaCl2(0～20 mmol/L)等因素對(duì)滌綸織物酶處理液中水解產(chǎn)物釋放量的影響。酶處理后的織物先后用1%十二烷基硫酸鈉和20%乙醇清洗,然后放入烘箱中烘干以備后續(xù)測(cè)試。

1.3 測(cè) 試

1.3.1 對(duì)苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用紫外分光光度法測(cè)定突變T.fusca角質(zhì)酶處理殘液中產(chǎn)物對(duì)苯二甲酸(TPA)的釋放量,參照文獻(xiàn)[11]繪制對(duì)苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示。得出對(duì)苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:

A=7.14 286×10-4+5.69×10-3×C(R2=0.999 5)

(1)

式中:A為240 nm處的紫外吸光度值,C為TPA質(zhì)量濃度。

圖1 TPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for TPA

1.3.2 酶處理殘液吸光度測(cè)試

將突變T.fusca酶反應(yīng)液置于100 ℃的水浴鍋中保溫30 min使酶失活,并在離心機(jī)中以8 000 r/min的速度離心10 min后取上清液進(jìn)行紫外測(cè)試。在其他反應(yīng)條件一樣的情況下,以不加織物的酶處理液為參比,在240 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品處理液的吸光度。

1.3.3 滌綸水解產(chǎn)物種類分析

用安捷倫1200系列的高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)在240 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)滌綸織物的水解產(chǎn)物種類,其中流動(dòng)相甲醇︰水=65︰35,流速0.5 mL/min,進(jìn)樣量5 μL。

1.3.4 滌綸織物表面形貌觀察

為了進(jìn)一步分析滌綸纖維經(jīng)酶處理后表面形態(tài)的變化,本研究利用SU1510掃描電子顯微鏡(日本日立公司)在放大倍數(shù)分別為3 000、10 000倍時(shí)進(jìn)行觀察,其中電壓設(shè)置為5 kV。

1.3.5 接觸角測(cè)試

在恒溫恒濕條件下,利用DSA 25接觸角測(cè)量?jī)x(德國(guó)KRUSS公司)對(duì)處理前后試樣的水接觸角進(jìn)行測(cè)量,當(dāng)水滴滴下5 s后,對(duì)接觸角數(shù)值進(jìn)行記錄。其中液滴體積為10 μL,滴液速度為1 mL/min。

1.3.6 回潮率測(cè)試

織物吸濕性能用回潮率表示,按GB/T 6529—2008《紡織調(diào)濕和試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)大氣》,在溫度(20±1) ℃、濕度(65±2)%的試驗(yàn)環(huán)境測(cè)試。

(2)

1.3.7 滌綸織物表面基團(tuán)變化分析測(cè)試

角質(zhì)酶水解滌綸分子鏈上的酯鍵可產(chǎn)生羥基等親水性基團(tuán),從而吸附陽(yáng)離子型的亞甲基藍(lán)染料。因此,通過(guò)檢測(cè)滌綸織物的染色深度,可以表征織物表明活性基團(tuán)的變化[12]。同時(shí),亞甲基藍(lán)染料在660 nm左右波長(zhǎng)下有特征吸收峰,可測(cè)試染色前后樣品的吸光度[8]。同時(shí),為了探究改性織物對(duì)分散染料上染率的影響,用分散藍(lán)165染料對(duì)改性前后的織物進(jìn)行染色,特征吸收峰在665 nm左右。染色工藝條件:染料質(zhì)量濃度1 g/L,浴比1︰50,染色時(shí)間2 h,染色溫度60 ℃。染色后的滌綸織物用去離子水反復(fù)沖洗后,放在室溫下干燥48 h后,使用測(cè)配色儀測(cè)量K/S值。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變T.fusca角質(zhì)酶質(zhì)量濃度對(duì)水解產(chǎn)物釋放量的影響

酶質(zhì)量濃度是影響滌綸織物改性效果的重要因素,合適的酶質(zhì)量濃度既可以保證其對(duì)底物的催化活化能力,又不會(huì)造成資源的浪費(fèi)。探究角質(zhì)酶質(zhì)量濃度對(duì)水解產(chǎn)物釋放量的影響,可以得到反應(yīng)體系較合適的酶濃度。由圖2(a)可知,在溫度60 ℃、pH 8、時(shí)間48 h的條件下,隨著突變T.fusca角質(zhì)酶質(zhì)量濃度的增加,滌綸織物的水解產(chǎn)物釋放量增加。當(dāng)角質(zhì)酶質(zhì)量濃度在20 U/g時(shí),水解產(chǎn)物TPA的含量達(dá)到最大值。繼續(xù)增大酶質(zhì)量濃度,水解產(chǎn)物的量反而下降,一方面可能是滌綸纖維表面沒(méi)有足夠多的作用位點(diǎn)與角質(zhì)酶的活性位點(diǎn)結(jié)合導(dǎo)致催化水解效果降低[13]。另一方面也可能是中間水解產(chǎn)物對(duì)苯二甲酸單2羥乙酯(MHET)具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用而導(dǎo)致酶解作用降低[5]。

2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解產(chǎn)物釋放量的影響

角質(zhì)酶具有一定的活性周期,催化能力會(huì)隨著時(shí)間的變化而變化,因此需要根據(jù)水解產(chǎn)物釋放量得出合適的催化反應(yīng)時(shí)間。由圖2(b)可知,在角質(zhì)酶質(zhì)量濃度20 U/g、反應(yīng)溫度60 ℃、pH 8的條件下,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),滌綸織物的水解產(chǎn)物含量逐漸增加。處理時(shí)間在12～48 h,水解產(chǎn)物釋放量增加顯著,但當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)48 h后,產(chǎn)物的增加量趨于平緩。這是因?yàn)樵?8 h之前,突變T.fusca角質(zhì)酶可快速催化水解滌綸表面的酯鍵。但超過(guò)48 h后,滌綸表面可被水解的酯鍵數(shù)量變少,而大分子的蛋白酶很難滲入到結(jié)構(gòu)致密的滌綸分子內(nèi)部,使得酶與滌綸的可及性降低,水解速率下降[13]。

2.3 處理溫度對(duì)水解產(chǎn)物釋放量的影響

酶的穩(wěn)定性會(huì)受到溫度的影響,因此,合適的酶反應(yīng)溫度是保證酶活性和最大催化效率的重要因素。由圖2(c)可知,在角質(zhì)酶質(zhì)量濃度20 U/g、時(shí)間48 h、pH 8的反應(yīng)條件下,隨著處理溫度的升高,水解產(chǎn)物釋放量先增加后降低,在處理溫度為60 ℃時(shí)水解產(chǎn)物釋放量最高。這主要是因?yàn)闇囟缺容^低時(shí),角質(zhì)酶的活性沒(méi)有被全部激發(fā),但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí),酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆變化,導(dǎo)致其變性甚至失活,使水解產(chǎn)物的釋放量下降[13]。

2.4 pH值對(duì)水解產(chǎn)物釋放量的影響

pH值決定酶蛋白分子的電離狀態(tài),從而影響酶的活性和與底物的結(jié)合頻率,因此,合適的pH值會(huì)使得反應(yīng)速率增加。由圖2(d)可知,在角質(zhì)酶質(zhì)量濃度20 U/g、時(shí)間48 h、溫度60 ℃的反應(yīng)條件下,反應(yīng)液的pH值為8時(shí),水解產(chǎn)物釋放量最大;但當(dāng)pH值偏離8后,水解產(chǎn)物釋放量有所下降。這是因?yàn)楫?dāng)pH值過(guò)高或過(guò)低時(shí),突變T.fusca角質(zhì)酶的分子活性部位有關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)發(fā)生改變,酶的活性下降,其和底物之間的結(jié)合力降低,不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行[14]。

圖2 反應(yīng)條件對(duì)產(chǎn)物TPA釋放量(質(zhì)量濃度)的影響Fig.2 Influence of reaction conditions on TPA yield (mass-volume concentration)

2.5 金屬離子對(duì)水解產(chǎn)物釋放量的影響

合適的金屬離子在提高水解酶的熱穩(wěn)定性和催化行為中起著至關(guān)重要的作用[15]。基于Then等[16]的試驗(yàn),考察了不同濃度的Ca2+存在下對(duì)突變T.fusca角質(zhì)酶水解滌綸產(chǎn)物的影響。由圖3可以看出,當(dāng)Ca2+體積濃度從0增大至15 mmol/L時(shí),水解產(chǎn)物TPA釋放量從15 mg/L增加到25 mg/L,較單獨(dú)酶處理提高了53%,比Nimchua等[10]報(bào)道的尖孢鐮刀菌催化滌綸水解的產(chǎn)物濃度高28%。金屬離子的存在使TPA釋放量有較大提升,這是因?yàn)榻饘匐x子與酶的配體進(jìn)行了結(jié)合,酶活性中心的微環(huán)境得到改善,酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,酶熱穩(wěn)定性能增加[16-17]。

圖3 Ca2+體積濃度對(duì)TPA釋放量的影響Fig.3 Effect of Ca2+ volume concentration on TPA yield

2.6 水解產(chǎn)物種類測(cè)定

為揭示酶的水解作用機(jī)制,需進(jìn)一步對(duì)水解產(chǎn)物做鑒定分析。本研究將Ca2+和角質(zhì)酶體系催化滌綸水解反應(yīng)殘液進(jìn)行了高效液相色譜測(cè)定,結(jié)果如圖4所示。Puspitasari等[18]研究表明,聚酯的酯鍵水解會(huì)產(chǎn)生TPA、MHET、對(duì)苯二甲酸雙(2羥乙)酯(BHET)等多種產(chǎn)物,但Yoshida等[19]表明PETase水解酶會(huì)進(jìn)一步將水解產(chǎn)物BHET分解成MHET和TG。由圖4可以看出,該突變T.fusca角質(zhì)酶的主要水解產(chǎn)物是TPA,而中間水解產(chǎn)物MHET含量較少,BHET沒(méi)有被檢測(cè)到,推測(cè)是由于金屬離子的引入使得酶熱穩(wěn)定性能增加,從而將BHET進(jìn)一步被水解成MHET。除此之外,將突變T.fusca角質(zhì)酶與PETase等活性較高、降解聚酯塑料較優(yōu)異的酶復(fù)配用于滌綸改性上,以避免中間水解產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制也是一個(gè)值得探索的方向。

圖4 酶水解滌綸反應(yīng)液的液相色譜示意Fig.4 HPLC chart of enzymatic hydrolysis polyester reaction solution

2.7 滌綸織物表面形貌分析

酶處理前后滌綸織物的表面形貌如圖5所示。由圖5可見,未處理的織物表面比較光滑;而經(jīng)過(guò)酶處理后,滌綸織物表面呈現(xiàn)出不同程度的凹槽。這可歸因于酶對(duì)滌綸的無(wú)定形區(qū)進(jìn)行了水解,使得纖維表面變得粗糙,同時(shí)也可以看出酶對(duì)滌綸的水解僅限于表面一層,可保留滌綸本身的性能。

圖5 酶處理前后滌綸織物SEM圖Fig.5 SEM images of polyester fabric before and after enzyme treatment

2.8 滌綸織物表面潤(rùn)濕性能分析

滌綸織物經(jīng)過(guò)酶處理后,潤(rùn)濕性能有所改善,改善效果可由接觸角、回潮率、K/S值等表征。圖6為角質(zhì)酶處理前后滌綸織物的水接觸角與回潮率的變化。由圖6可見,織物經(jīng)Ca2+與角質(zhì)酶體系處理后接觸角由92.6°減小到76.4°,降低了17.5%;回潮率由0.64%增大到1.19%,增大了85.93%。主要原因?yàn)榻琴|(zhì)酶對(duì)大分子鏈中的酯基進(jìn)行水解,從而產(chǎn)生了親水性活性基團(tuán)。此外,由于角質(zhì)酶處理導(dǎo)致分子鏈斷裂,使纖維表面有裂隙現(xiàn)象,這可在掃描電鏡圖5中得到證實(shí)。圖7表示角質(zhì)酶處理前后滌綸織物的K/S值和染液吸光度值的變化。由圖7(a)可見,經(jīng)過(guò)角質(zhì)酶處理后,由亞甲基藍(lán)染色的滌綸織物K/S值增大,染液的吸光度值減小,說(shuō)明滌綸織物的大分子鏈水解,產(chǎn)生了親水性基團(tuán),使得染色深度增加。與原布相比,Ca2+與酶體系處理后的織物K/S值增加了17.9%,663 nm處的吸光度值減小了43%。由圖7(b)可知,改性前后的滌綸織物經(jīng)過(guò)分散藍(lán)165染料染色后,染色深度有所增加,但增加并不明顯。這是因?yàn)榉稚⑺{(lán)165染料只能進(jìn)入滌綸大分子非結(jié)晶區(qū),而酶蛋白的催化水解作用是在纖維表面,對(duì)滌綸纖維結(jié)晶度影響不大,因此織物的染色深度沒(méi)有顯著變化[20-21]。

圖6 酶處理前后織物接觸角和回潮率變化Fig.6 Changes in contact angle and moisture regain of fabricsbefore and after enzyme treatment

圖7 酶處理前后染液吸光度值與K/S值變化Fig.7 Changes of absorbance and K/S value of dye solution before and after enzyme treatment(注:柱狀圖為K/S值變化,折線圖為染液吸光度變化)

3 結(jié) 論

本研究采用突變T.fusca角質(zhì)酶對(duì)滌綸進(jìn)行表面改性處理,由水解產(chǎn)物釋放量確定最佳反應(yīng)條件。同時(shí)發(fā)現(xiàn)金屬離子可強(qiáng)化酶對(duì)滌綸的水解,使得水解產(chǎn)物釋放量提升。改性后的織物表面有凹槽、裂隙現(xiàn)象,潤(rùn)濕性能和染色性能得到改善。

1) 單因素變量分析確定突變T.fusca角質(zhì)酶水解滌綸織物適宜的反應(yīng)條件為:角質(zhì)酶質(zhì)量濃度20 U/g、溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間48 h、pH值為8。

2) 15 mmol/L的Ca2+的加入可使水解產(chǎn)物釋放量較單獨(dú)用酶處理提高53%,可強(qiáng)化酶對(duì)滌綸的水解作用。

3) 經(jīng)鑒定,水解產(chǎn)物主要是TPA,MHET占比較少,BHET沒(méi)有被檢測(cè)到。角質(zhì)酶處理后的纖維有明顯的刻蝕現(xiàn)象。同時(shí),與未經(jīng)過(guò)酶改性處理的織物相比,酶改性織物的K/S值提升,亞甲基藍(lán)的染液吸光度下降43%,接觸角降低17.5%,回潮率增大85.93%,表明角質(zhì)酶使得滌綸酯鍵斷裂,纖維表面產(chǎn)生親水性基團(tuán),潤(rùn)濕性能得到改善。

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