Rab蛋白參與結核分枝桿菌胞內吞噬的研究進展

孫巧玲，袁 欣，秦 歡，王 玉

(遵義醫科大學 基礎醫學院 微生物學教研室， 貴州 遵義 563003)

結核病(tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis，Mtb)引起的嚴重傳染病。雖然已有疫苗進行預防接種，每年全球仍有超過1 000萬新發結核病例，100余萬人死于結核相關的疾病[1]。中國每年新增超過80萬結核病病例。近年來由于多重耐藥菌株的出現、艾滋病雙重感染病例的增多以及免疫抑制劑的濫用導致結核病的發病率和死亡率不斷上升。

Mtb主要經由呼吸道進入機體，到達肺部遠端，隨后被肺泡巨噬細胞或樹突狀細胞捕獲，內化形成含Mtb吞噬體。對于普通細菌，細胞內吞噬體能與溶酶體結合形成吞噬溶酶體，再通過吞噬體酸化、水解酶、氧化酶作用等來清除細菌[2]。而Mtb能夠通過其菌體成分干擾宿主細胞內吞噬作用，進而阻止吞噬體成熟，使得Mtb能夠在細胞內存活和增殖[3]。

Rab蛋白屬于小GTP酶家族，在真核細胞中廣泛表達，調控了胞內各種膜轉運過程，包括吞噬過程。大量研究表明Rab蛋白與結核分枝桿菌胞內吞噬密切相關。因此，本綜述著重討論影響胞內吞噬作用的Mtb菌體成分以及Rab蛋白對Mtb吞噬的影響，以期深入了解Mtb與Rab蛋白在胞內吞噬中的相互作用，探索Mtb的胞內免疫機制。

1 Mtb對于胞內吞噬過程的影響

吞噬是胞內抵抗病原菌感染的重要防御機制之一。吞噬過程包括了病原菌識別、吞噬體的形成、吞噬溶酶體成熟、病原菌降解4個階段。Mtb首先被機體吞噬細胞如巨噬細胞表面Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)等識別后，內吞進入細胞內形成吞噬體，通過菌體成分干擾和阻止胞內吞噬，細菌能在胞內存活和增殖。由此可見，Mtb菌體成分與吞噬過程的相互作用決定了其胞內吞噬的結局。

1.1 Mtb脂質對胞內吞噬的影響

Mtb脂質是Mtb的主要毒性因子，與結核病的發生密切相關。Mtb存在大量脂質，如脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped lipoarabinomannan，ManLAM)等。ManLAM廣泛分布于Mtb表面，是一種復雜的脂聚糖，它能與甘露糖受體(mannose receptor，MR)結合，進而介導Mtb吞噬。而且ManLAM還能阻斷吞噬體與溶酶體的融合，幫助細菌在胞內存活[4]。此外，有些Mtb脂類可通過調節ManLAM來影響胞內吞噬過程。P27是牛型結核分枝桿菌等表達的一種分泌型表面糖脂蛋白，因其能與P55共同協助Man-LAM組裝和轉運到細胞表面，故P27缺失時，可導致細菌表面Man-LAM表達減少，進而促進巨噬細胞內吞噬體的成熟[5]。此外，P27還能通過與DC-SIGN受體結合，介導Mtb與宿主間的黏附。Mtb細胞壁脂質成分PDIM(phthiocerol dimycocerosates)與Mtb胞內逃逸相關。PDIM可通過排出吞噬體膜中空泡質子ATP酶來阻斷吞噬體的酸化，也能通過增加吞噬體膜通透性和造成膜損傷來幫助細菌存活和增殖[6]。

1.2 Mtb蛋白質對胞內吞噬的影響

目前已知結核分枝桿菌能夠產生多種酶類，如蛋白激酶G(protein kinase G，PKnG)、酪氨酸激酶A(tyrosine kinase A，PtKA)等。PKnG類似于蛋白激酶，可通過增加胞內信號傳導來阻止吞噬體和溶酶體的融合，干擾吞噬體成熟；另一方面，PKnG也具有泛素激活酶和泛素連接酶功能，能夠調節腫瘤壞死因子受體相關因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2)和β-TGF活化激酶1(TGF-beta-activated kinase 1，TAK1)的泛素化和降解來抑制NF-κB通路激活，從而抑制機體免疫力[7]。PtKA缺失時，Mtb不能抑制吞噬體酸化，導致巨噬細胞內細菌死亡[8]。此外，Mtb H37Rv菌株產生的蘋果酸合酶(malate synthase，MS)GlcB是一種幫助Mtb在缺氧環境中以甘油為碳源增殖時必需的酶類。當GlcB缺失時，Mtb與溶酶體標志物LAMP1共定位增加，細菌載量增加，提示GlcB能夠阻止吞噬體成熟[9]。肌微管素相關蛋白4(myotubularin-related protein-4，MTMR4)是一種肌微管素-3-磷酸磷脂酰肌醇磷酸酶，表達減少時能夠升高巨噬細胞表面免疫球蛋白受體FcγRs(Fc gamma receptors)的表達，并增加3-磷酸磷脂酰肌醇[phosphatidylinositol 3-phosphate，PtdIns(3)P]在吞噬體膜上持續的時間，從而抵抗海洋分枝桿菌誘導的吞噬體阻斷作用[10]。此外，PtpA、SapM等磷脂酶缺失時，海洋分枝桿菌可招募更多的Ptdlns3P，故磷脂酶參與了分枝桿菌的胞內逃逸機制，而且PtpA還可通過阻斷V-ATP酶的招募來減少含菌囊泡的酸化，阻斷吞噬體成熟[11]。Rv3091屬于馬鈴薯糖蛋白樣磷脂酶家族，能夠促進結核分枝桿菌從巨噬細胞吞噬體中逃逸，促進細菌的胞內存活[12]。O-甘露糖轉移酶(protein O-mannosyl transferase，PMT)能夠催化結核分枝桿菌O-甘露糖基化蛋白。PMT缺失時，恥垢分枝桿菌不能阻斷吞噬體和溶酶體的融合，導致巨噬細胞內細菌增殖減少，同時也引起細胞分泌TNF-α和IL-6減少[13]。

除了酶類外，Mtb還能產生WhiB3、Rv3463等蛋白質。Wbl家族蛋白WhiB3是結核分枝桿菌whiB編碼的一種對氧化還原反應敏感的轉錄因子，能夠檢測細菌內氧化還原電勢。其在囊泡內酸性pH環境中調節胞質內放線硫醇氧化還原電勢(EMSH)，從而阻斷吞噬體的成熟。此外，WhiB3除了通過改變多聚乙酰脂合成來阻止吞噬體的成熟外，也能夠通過緩解由過氧化氫異丙苯、過氧化氫和酸化亞硝酸鹽和過氧亞硝酸鹽導致的氧化還原壓力[14]。Rv3463是從Mtb培養懸液中分離得到的一種蛋白質，它能促進Mtb與早期吞噬體標志(如Rab5、VPS34)，及晚期吞噬體標志Rab7共定位，幫助吞噬體成熟。轉染Rv3463的恥垢分枝桿菌感染小鼠后，小鼠載菌量明顯減少，這些結果提示Rv3463可通過促進吞噬來減少Mtb的感染[15]。Mtb產生的分泌性蛋白ESAT-6(the 6-kDa early secreted antigenic target)，又稱EsxA，是ESX-1型VII分泌系統的一種關鍵效應分子。ESAT-6與PDIM作用相似，能夠破壞吞噬體膜，PDIM還能促進ESAT-6的作用，而且ESAT-6還能誘導細胞IFN-Ⅰ的產生[16]，或誘導巨噬細胞線粒體中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD-2)來幫助細菌存活[17]。此外，ESAT-6還可通過促進HIF1α基因表達來增強巨噬細胞的吞噬能力[18]。ESX-1還可通過下調miR-147-3p來抑制促進海洋分枝桿菌的存活[19]。

2 Rab蛋白對Mtb胞內吞噬過程的影響

Rab GTP酶是小GTP酶Ras超家族中最大的成員之一，目前在人體中已發現超過70種Rab蛋白。編碼Rab蛋白的基因約為600 bp，序列保守性較高，在不同物種間其序列同源性高達75%～95%。Rab蛋白約含有200個氨基酸，具有一些共同的結構特征，如G結構域等。Rab蛋白與GTP結合后活化，行使調節胞內膜轉運的功能；而當Rab蛋白與GDP結合，Rab蛋白處于失活狀態。這一轉換過程受到鳥苷酸交換因子(GMP exchange factors，GEFs)和GTP酶活化蛋白(GTPase-activating protein，GAPs)的調控。Rab蛋白在真核生物內幾乎所有膜相關細胞器中均存在，調節胞內各種生命活動，包括胞內吞噬作用。

最早有關Rab蛋白調節Mtb吞噬作用的研究主要是分離Mtb吞噬體，檢測Rab蛋白的表達差異。強毒株Mtb吞噬體招募的Rab蛋白與普通病原菌和弱毒株Mtb均不同，這表明Rab蛋白在Mtb吞噬中具有獨特的作用，具有深入研究的價值。

2.1 Rab5和Rab7

Rab5和Rab7分別是早期吞噬體和晚期吞噬體的標志，常用于吞噬體成熟過程的檢測，在麻風病患者的病變皮膚中表達較高。BCG吞噬體僅能夠募集Rab5，不能募集Rab7。在鳥型結核分枝桿菌研究中發現類似結果：無論野生型Rab5、活化型Rab5(Q79L Rab5)還是抑制型Rab5(S34N Rab5)均能被募集至骨髓來源的巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages，BMMs)內吞噬體上；而野生型Rab7、抑制型Rab7(S22N Rab7)和活化型Rab7(Q67L Rab7)并不能。后證實Rab7能夠被募集到Mtb吞噬體上，但募集后很快被釋放。這可能與活BCG感染抑制Rab7效應分子RILP(Rab7-interacting lysosomal protein)募集，進而阻止了活化型Rab7與RILP的相互作用，阻斷晚期吞噬體形成有關。同時也可能是由于Mtb感染促進吞噬體上Rab7釋放，進而導致Rab7-RILP-動力蛋白/動力蛋白激活蛋白復合物分解，從而阻斷吞噬體與溶酶體的融合[20]。Rab7還通過影響脂滴與吞噬體之間的相互作用來調節結核分枝桿菌吞噬[21]。

2.2 Rab10蛋白

Rab10最早是在犬腎上皮細胞系MDCK細胞中被檢測到，它參與了基底膜蛋白的胞內轉運。Rab10能夠較Rab5更早地被募集至吞噬體，敲除Rab10或者抑制型Rab10可延遲含熱處理Mtb吞噬體的成熟；而過表達Rab10或活化型Rab10能夠部分地促進吞噬體的成熟[22]，從而促進Mtb的胞內清除，有些miRNA，如miR378d下調時可導致Rab10表達增加，從而促進巨噬細胞吞噬清除細菌[23]。

2.3 Rab14蛋白

Rab14定位于早期內吞體、高爾基體和轉運高爾基體等膜結構，參與了這些膜結構的胞內轉運過程。沉默Rab14或抑制型Rab14表達時，能夠促進Mtb吞噬體成熟。相反，過表達Rab14或活化型Rab14表達時，Mtb吞噬體成熟受阻，維持早期吞噬體特征[24]。

2.4 Rab20蛋白

Rab20定位于高爾基體、內質網以及其他內吞體，屬于干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)誘導可產生的GTP酶，其在活動性肺結核病患者的痰液標本中表達較高。沉默Rab20或抑制型Rab20表達時能促進吞噬體的成熟，同時縮短吞噬體上Rab5存在的時間。但Rab20并不影響Mtb的存活。此外，Rab20能夠募集Rab5鳥苷酸交換因子Rabex5至吞噬體，能短暫地增加吞噬體上活化型Rab5的表達[25]，使得Mtb吞噬體更久地維持在早期吞噬體階段。

3 Mtb通過調節Rab蛋白而影響胞內吞噬過程

有關Mtb菌體成分通過調節Rab蛋白而影響胞內吞噬作用的研究已有報道，如PknG。Rab7L1(小鼠Rab29)與細胞內膜-反面高爾基體網絡(trans-Golgi network，TGN)的完整性相關，能夠調節從高爾基體到溶酶體的轉運過程，能夠被募集到含菌吞噬體上。PknG缺失的恥垢分枝桿菌和BCG能夠在敲除Rab7L1的巨噬細胞內存活，當PknG存在時， 能夠阻止Rab7L1轉變成Rab7L1-GTP，導致吞噬溶酶體形成受阻[26]。

4 問題與展望

Mtb胞內吞噬過程十分復雜，涉及到Mtb菌體成分與胞內吞噬過程的相互作用。一方面，Mtb可通過3條途徑來調節吞噬過程(圖1)：第一，抑制吞噬溶酶體酸化，減少吞噬細胞對細菌的清除；第二，阻斷吞噬體成熟過程，幫助細菌在胞內長期存活；第三， 破壞吞噬體膜， 增加胞質內細菌的免疫逃逸。

另一方面，不同Rab蛋白在Mtb吞噬中作用不同，如活化型Rab10等能夠抑制Mtb吞噬，而抑制型Rab14等具有阻斷Mtb吞噬作用。雖然已有Mtb菌體成分與Rab蛋白在胞內吞噬過程中的相互作用方面的研究，但目前仍然比較少，許多問題尚未解決。如哪些Rab蛋白在Mtb胞內吞噬中發揮了關鍵作用，哪些Mtb菌體成分能夠調控Rab蛋白來阻斷吞噬途徑。這些方面的深入研究將有利于揭示Mtb胞內免疫機制，為結核病的治療和疫苗的研發提供新的思路和研究靶點。

圖1 結核分枝桿菌菌體成分對胞內吞噬作用的示意圖Fig 1 Schematic diagram indicating the effect of the components of M.tuberculosis on intracellular phagocytosis