EphB2受體在腦缺血模型大鼠功能恢復(fù)不同階段中的表達(dá)

張潔婷，李海僖，王婷婷，云 璐，楊 海

(青島市中心醫(yī)院 藥學(xué)部， 山東 青島 266042)

缺血性卒中(ischemic stroke)是引起患者癱瘓和死亡的主要病因，通常分為3個(gè)階段，即急性期、亞急性期和慢性期，康復(fù)治療是進(jìn)入亞急性期后的最佳治療方法[1]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為康復(fù)治療應(yīng)盡早進(jìn)行，然而近期研究表明，急、亞急性期進(jìn)行康復(fù)治療會(huì)導(dǎo)致更差的臨床結(jié)局，慢性期功能恢復(fù)則需要高強(qiáng)度的康復(fù)干預(yù)[2-3]，這提示即使同一信號(hào)通路在卒中的3個(gè)階段也可能發(fā)揮不同的作用。

促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞B2受體(erythropoietin-producing hepatocyte B2 receptor，EphB2受體)是酪氨酸激酶受體家族中的一個(gè)亞型，高表達(dá)于成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)且作用廣泛[4]。目前缺血性卒中發(fā)生后EphB2受體在其中的作用仍不明確，一方面其可放大神經(jīng)元興奮性毒性加重?fù)p傷[5]；另一方面激活EphB2受體可增強(qiáng)突觸重塑，促進(jìn)神經(jīng)功能的康復(fù)[6-7]，尚未見有研究對(duì)此作出合理解釋。考慮到這些研究多是在卒中的某一特定階段進(jìn)行的，因此本研究假設(shè)這種矛盾可能是由于EphB2受體在腦缺血發(fā)生后不同階段的不同作用所導(dǎo)致的。為證實(shí)這一假設(shè)，本課題通過建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型(middle cerebral artery occlusion, MCAO)，初步探討EphB2受體在腦缺血模型大鼠功能恢復(fù)過程中不同階段的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)，雄性SD大鼠64只，體質(zhì)量240～260 g[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為：SCXK(京)2012-0001]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：考馬斯亮藍(lán)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴(kuò)增試劑盒(日本TaKaRa公司)；EphB2一抗(Cell Signaling公司，83029)；GAPDH一抗(賽默飛世爾科技有限公司，MA5-15738)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：按照隨機(jī)原則選擇13只大鼠作為假手術(shù)組(sham)，其余大鼠應(yīng)用線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型(middle cerebral artery occlusion, MCAO)[8]，經(jīng)激光散斑血流成像技術(shù)確認(rèn)造模成功的大鼠[9]用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，共51只。缺血2 h后將線栓輕輕拽出，并進(jìn)行編號(hào)分組，分別為MCAO術(shù)后2、14和28 d組。

1.2.2 激光散斑血流成像技術(shù)監(jiān)測(cè)腦血流量：將大鼠以俯臥位固定，乙醇擦拭頭部皮膚，剪開頭皮，暴露出頭骨十字，腦血流監(jiān)測(cè)區(qū)域如圖1所示，分別于MCAO術(shù)前、術(shù)后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)大腦皮質(zhì)血流量，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)持續(xù)監(jiān)測(cè) 30 s，皮質(zhì)血流量通過激光散斑成像(laser speckle imaging, LSI)系統(tǒng)測(cè)定。

1.2.3 2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(2, 3, 5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride, TTC)染色檢測(cè)大腦梗死情況：將腦切片浸于1% TTC中，37 ℃溫箱避光孵育30 min，4%多聚甲醛固定30 min后拍照，缺血區(qū)顯示蒼白色，未缺血區(qū)顯示鮮紅色。

1.2.4 MCAO大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)價(jià)方法：采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分[10](modified neurological severity scores，mNSS)，分別在MCAO術(shù)后2、14和28 d進(jìn)行神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分。評(píng)分內(nèi)容包括運(yùn)動(dòng)綜合測(cè)試(肌肉狀況、異常行為、懸尾實(shí)驗(yàn))、感覺測(cè)試(視覺、觸覺和本體感受)、反射和平衡測(cè)試。mNSS評(píng)分范圍為0～18分，評(píng)分越高，表明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.2.5 Western blot檢測(cè)EphB2受體蛋白表達(dá)量：各組大鼠腦組織樣本經(jīng)組織裂解法提取后，得到該樣本的蛋白質(zhì)提取液，蛋白含量按考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，加入上樣緩沖液后高溫滅活5 min。取30 μg樣本上樣行10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)電泳將目的蛋白充分分離后，根據(jù)蛋白Marker所指示的位置將含有目的蛋白的膠帶切下，采用濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白從膠帶中轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)過5% BSA封閉1 h后漂洗，加入相應(yīng)抗體孵育過夜，次日條帶經(jīng)漂洗后用相應(yīng)二抗進(jìn)行孵育，隨后采用電化學(xué)發(fā)光法顯色，檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 q-PCR檢測(cè)EphB2 mRNA表達(dá)量：小鼠腦區(qū)組織經(jīng)Trizol等試劑提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)。所得cDNA在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。每次擴(kuò)增的同時(shí)設(shè)置cDNA的陰性對(duì)照。將PCR產(chǎn)物做融解曲線，以證實(shí)以上PCR反應(yīng)產(chǎn)物特異性良好。統(tǒng)計(jì)2△△Ct值以比較各組mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。EphB2 mRNA引物序列為：5′-AGGTGATTGGAGCAGGGGAA-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腦缺血大鼠的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能呈自發(fā)性恢復(fù)

首先通過LSI技術(shù)篩選手術(shù)成功的MCAO模型大鼠(圖1A)，右側(cè)腦血流量(藍(lán)色框)明顯下降的大鼠可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，且經(jīng)TTC染色(圖1B)證實(shí)，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠右側(cè)大腦有明顯梗死且界限分明，確定MCAO模型造模成功。隨后，造模成功的大鼠被分為假手術(shù)組、MCAO術(shù)后2、14和28 d組，并通過改良型mNSS評(píng)分評(píng)價(jià)以上4組大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。與假手術(shù)組相比，MCAO術(shù)后2 d的mNSS評(píng)分顯著增加，且術(shù)后14和28 d mNSS總評(píng)分逐漸降低，表明大鼠腦缺血后的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能呈自發(fā)性恢復(fù)趨勢(shì)(圖2)。

2.2 海馬區(qū)EphB2受體在腦缺血后功能恢復(fù)過程中先增加后降低

與假手術(shù)組相比，EphB2受體在MCAO術(shù)后2 d的表達(dá)顯著增加。與MCAO術(shù)后2 d相比，術(shù)后28 d的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。此外，mNSS總評(píng)分與海馬區(qū)EphB2受體表達(dá)量具有相關(guān)性(R值為0.618 3)(圖3)。

2.3 皮質(zhì)區(qū)EphB2受體在腦缺血后功能恢復(fù)過程中未見顯著改變

與假手術(shù)組相比，皮質(zhì)區(qū)EphB2受體表達(dá)量在MCAO術(shù)后2、14和28 d各組之間均無差異(圖4)。

A.laser speckle flow imaging in model assessment, compared with the sham group, the MCAO model group exhibited narrower or absent dextral blood flow, which indicated that the model was established successfully; B.representative images of TTC staining;compared with the sham group, the MCAO model group showed infarcted region (white)

The results showed that the neurological and motor recovery was emerging after cerebral ischemia (n=8, 6, 5, 4); *P<0.001 compared with sham； #P<0.01 compared with 2 days after MCAO圖2 MCAO術(shù)后不同時(shí)間的mNSS評(píng)分Fig 2 Modified neurological severity scores (mNSS) were measured at different stages after

2.4 海馬區(qū)EphB2 mRNA在腦缺血后功能恢復(fù)過程中未見顯著改變

與假手術(shù)組相比，海馬區(qū)EphB2 mRNA表達(dá)量在MCAO術(shù)后2、14和28 d各組之間均無差異(圖5)。

3 討論

已有研究證實(shí)，在缺血性卒中的不同階段， 同樣的治療卻產(chǎn)生相反的結(jié)果，這提示即使同一信號(hào)通路在卒中的3個(gè)階段也可能發(fā)揮不同的作用。在本研究中，首先制備MCAO模型，該模型是研究缺血性卒中最常用且公認(rèn)的動(dòng)物模型[11]；隨后采用LSI技術(shù)篩選手術(shù)成功的模型大鼠，與傳統(tǒng)的激光多普勒血流儀相比，其具有快速、分辨率高、可進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)控等優(yōu)勢(shì)[9]。隨后，通過TTC染色證實(shí)，模型大鼠右側(cè)大腦有明顯梗死，進(jìn)一步確定了MCAO模型造模成功。

MCAO造模2 d后大鼠神經(jīng)功能損傷最嚴(yán)重，此時(shí)海馬區(qū)EphB2表達(dá)明顯上調(diào)，這與在梗死同側(cè)腦組織[5]和梗死灶附近皮質(zhì)[12]的結(jié)果一致。這兩項(xiàng)研究均表明在腦缺血急性期EphB2激活，參與缺血后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。此外缺血后14、28 d大鼠神經(jīng)功能逐漸恢復(fù)，海馬區(qū)EphB2亦逐漸降低，與神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況密切相關(guān)。但與假手術(shù)組相比，缺血后14 d海馬區(qū)EphB2表達(dá)仍然升高，這與之前的研究[13]結(jié)果一致，其研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后14 d海馬區(qū)EphB2表達(dá)升高，且海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖及內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生增加[13]。因此，綜上所述，在腦缺血急性期海馬區(qū)EphB2受體的過度激活可促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)急性損傷的發(fā)生，而在亞急性期該受體的適度激活可促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

A.the EphB2 protein in hippocampus was increased at early stage and then decreased with time during the functional recovery after MCAO(n=12, 15, 8, 7); B.the expression of EphB2 protein showed correlation with the mNSS scores; *P<0.05 compared with sham; #P<0.05 compared with 2 days after MCAO

圖4 MCAO術(shù)后不同時(shí)間皮層區(qū)EphB2受體的表達(dá)變化Fig 4 Expression of EphB2 protein in cortex was measured on different stages after MCAO

然而在皮質(zhì)區(qū)檢測(cè)中未發(fā)現(xiàn)其發(fā)生明顯變化，原因有兩點(diǎn)，一是相較于皮質(zhì)區(qū)，海馬區(qū)是神經(jīng)再生較為敏感的腦區(qū)[14]，故其對(duì)外界損傷的反應(yīng)和自我修復(fù)能力也相應(yīng)較強(qiáng)；二是用于實(shí)驗(yàn)的皮質(zhì)區(qū)未區(qū)分梗死同側(cè)和對(duì)側(cè)， 可能對(duì)結(jié)果造成一定干擾。同時(shí)， 腦缺血后海馬區(qū)EphB2 mRNA的表達(dá)亦未見顯著變化，其原因可能為EphB2蛋白變化不是由于轉(zhuǎn)錄水平的變化，而是由于翻譯水平的調(diào)控，例如microRNA、lncRNA、ceRNA等。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)MCAO造模后大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能呈自發(fā)性恢復(fù)趨勢(shì)，海馬區(qū)EphB2受體表達(dá)先上調(diào)后逐漸降低，與大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況密切相關(guān)。根據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，海馬區(qū)EphB2受體可能在腦缺血后的不同階段發(fā)揮不同作用。

圖5 MCAO術(shù)后不同時(shí)間海馬區(qū)EphB2 mRNA的表達(dá)變化Fig 5 Expression of EphB2 mRNA in hippocampus at different stages after