乳中甲醛存在狀態與影響因素研究

金福榮, 霍喜月, 馮志彪, 萬洋, 姜瞻梅, 富天昕, 劉卜瑋, 田波

（1.東北農業大學食品學院, 哈爾濱 150030；2.東北農業大學理學院, 哈爾濱 150030）

0 引言

甲醛是一種有機化學物質, 有較強的毒性, 在我國有毒化學品優先控制名單中列居第二位, 是潛在的強致突變物之一[1-5], 被世界衛生組織確定為Ⅰ類致癌物[6], 過量攝入甲醛會對人體產生危害。以往我國允許甲醛在食品中應用, 如《食品添加劑衛生標準》（GB2760-2007）[7]中允許甲醛作為食品加工助劑使用。2011年, 《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB2760-2011）[8]將其刪除, 不再允許在食品中使用。

甲醛在食品中應用可以起到防腐、增重等作用, 其主要被非法添加于水產品、乳肉及其制品、蔬菜中[9-10]。甲醛加入牛乳中可延長其保質期[11], 因此曾有極少數不法分子將其加入牛乳中來防止牛乳腐敗變質。目前對于乳中甲醛的研究主要集中在甲醛的檢測方法上[12-21], 即前處理方法與測定方式, 但是對生乳中甲醛的存在狀態的研究較少。基于此, 本文采用乙酰丙酮法系統研究了生乳中甲醛的存在狀態及其影響因素, 對生乳中甲醛的測定有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生乳, 哈爾濱市香坊區奶戶；甲醛標準溶液, 環境保護部標準樣品研究所；冰乙酸, 天津市富宇精細化工有限公司；乙酰丙酮, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸銨, 天津市致遠化學試劑有限公司；三氯乙酸, 天津永晟精細化工有限公司；乳糖, 天津市天力化學試劑有限公司；干酪素, 北京奧博星生物技術有限責任公司；乳清蛋白, 大連美侖生物技術有限公司。

79-1磁力加熱攪拌器, 江蘇金壇市雙捷實驗儀器廠；UV-6100型紫外可見分光光度計及AL204電子天平, 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；101-OA電熱恒溫干燥箱, 北京東聯哈爾儀器制造公司；TG16-WS高速臺式離心機, 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；HH-4數顯恒溫攪拌水浴鍋, 金壇市城東新瑞儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 游離態甲醛測定標準曲線的繪制

取適量生乳樣放置于超濾離心管中, 4 000 r/min離心30 min, 制得清液1。使用清液1配制甲醛濃度為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/L的甲醛標準使用液。

參照HJ 601-2011[22]配制乙酰丙酮溶液, 取11支具塞比色管, 依次加入2.0 mL上述配制的甲醛標準使用液和2.5 mL乙酰丙酮溶液, 定容至25 mL, 60℃水浴反應15 min, 于413 nm下測定吸光度值, 甲醛濃度0 mg/L為空白對照, 測定3組平行值。以甲醛濃度為橫坐標, 吸光度為縱坐標, 繪制標準曲線, 用于后續試驗計算游離態甲醛的含量。

1.2.2 可逆結合態甲醛測定標準曲線的繪制

參照李薇霞的方法[23], 配制濃度為10%的三氯乙酸（TCA）, 取適量生乳樣, 1∶2體積加入TCA, 5 000 r/min離心10 min, 制得清液2。使用清液2配制甲醛濃度為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/L的甲醛標準使用液。取11支具塞比色管, 參照1.2.1的步驟, 以甲醛濃度為橫坐標, 吸光度為縱坐標, 繪制標準關系曲線, 用于后續試驗計算可逆結合態甲醛的含量。

1.2.3 乳中不同狀態甲醛含量的測定

以往報道涉及乳中甲醛的測定, 一般都是研究甲醛的測定方法, 沒有對乳中甲醛的存在狀態進行分析, 一般是只測定游離態甲醛或測定游離態甲醛和可逆結合態甲醛之和[12-21,24-25]。本試驗所用樣品均為乳外加甲醛所制得, 因此乳中總甲醛含量是已知的, 對乳中甲醛超濾離心測得的是其中的游離態甲醛, 而經蛋白沉淀后離心后測得的是游離態甲醛與可逆結合態甲醛的總和。

有研究發現牛乳中含有極低量的內源性甲醛[17]。在本試驗所用的乳樣品中使用乙酰丙酮法未檢出甲醛, 故向其添加甲醛制得甲醛陽性乳樣, 該甲醛陽性乳樣的甲醛濃度為10 mg/L。

（1）游離態甲醛的測定。

取10.0 mL乳樣于超濾離心管中, 4 000 r/min離心30 min。取2.0 mL清液于25 mL具塞比色管中, 加入2.5 mL乙酰丙酮溶液, 定容, 混勻, 60℃水浴反應15 min, 于413 nm下測定吸光度值, 根據1.2.1的標準曲線計算乳中的游離態甲醛含量。以不含甲醛的乳樣品為空白, 測定3組平行值。

（2）可逆結合態甲醛的測定。

取10.0 mL乳樣于離心管中, 加入10%TCA20.0 mL, 5 000 r/min離心10 min。取2.0 mL清液于25 mL具塞比色管中, 加入2.5 mL乙酰丙酮溶液, 定容, 混勻, 60℃水浴反應15 min, 于413 nm下測定吸光度值, 根據1.2.2的標準曲線計算甲醛含量, 此甲醛含量為可逆結合態甲醛和游離態甲醛含量之和, 可逆結合態甲醛含量=計算值-游離態甲醛含量。以不含甲醛的乳樣品為空白, 測定3組平行值。

（3）不可逆結合態甲醛的測定。

由于不可逆結合態甲醛無法測定, 以總甲醛含量減去游離態甲醛和可逆結合態甲醛計算所得為不可逆結合態甲醛的含量。

1.2.4 乳中甲醛存在狀態的影響因素

（1）溫度對乳中甲醛存在狀態的影響。

室溫（25℃）、冷藏（4℃）處理：配制甲醛濃度為10 mg/L的乳樣品, 于室溫和冷藏下放置1 h, 按照

1.2.3 方法測定樣品中不同狀態甲醛的含量。

加熱處理：取甲醛濃度10 mg/L乳樣品, 放置在具塞錐形瓶中, 分別在30、40、50、60、70、80、90、100℃水浴加熱1 h, 冷卻, 按照1.2.3方法分別測定經加熱處理的樣品中不同狀態甲醛的含量。

（2）時間對乳中甲醛存在狀態的影響。

配制甲醛濃度為10 mg/L的乳樣品, 分別于室溫和冷藏下放置1、2、4、6、8、12、24 h；另取乳樣, 分別在40、70℃下水浴加熱20、40、60、80、100 min。根 據1.2.3的方法測定不同條件下、不同處理時間的乳樣中不同狀態甲醛的含量。

1.2.5 乳成分與甲醛的結合

（1）乳糖。

配制乳糖濃度為3%、甲醛濃度為10 mg/L的樣品, 取10.0 mL于室溫下放置1、4、8、12、24、36、48 h, 測定其中游離態甲醛含量, 計算結合態甲醛含量。

（2）乳蛋白。

配制酪蛋白濃度為2.4%、甲醛濃度為10 mg/L的樣品和乳清蛋白濃度為0.6%、甲醛濃度為10 mg/L的樣品, 分別取10.0 mL于室溫放置1、4、8、12、24、36、48 h, 測定其中游離態甲醛含量, 計算結合態甲醛含量。

1.2.6 數據處理

每個樣品至少做3次平行實驗。應用Origin 2021和SPSS Statistics 23.0對實驗數據進行統計分析和作圖, 數據用平均值±標準偏差表示。通過配對T檢驗和單因素方差分析比較組間數據, 圖中不同的字母表示有統計學差異（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 乳中甲醛存在狀態的測定

乳中甲醛的狀態為游離態、可逆結合態和不可逆結合態。對牛乳樣品中的游離態甲醛通過超濾離心提取, 可逆結合態甲醛通過在牛乳樣品中加TCA沉淀蛋白提取, 乙酰丙酮法測定其中甲醛含量, 不可逆結合態甲醛的含量無法測定, 通過總甲醛含量減游離態和可逆結合態甲醛含量計算所得。結果見表1。

表1 牛乳中不同狀態甲醛含量

由表1可見, 在測定的乳樣中, 添加甲醛濃度為3.00～10.00 mg/mL。經乙酰丙酮法測定其中游離態甲醛含量約占30%, 可逆結合態甲醛約占56.5%, 不可逆結合態甲醛約占13.5%, 結合態甲醛含量約占70%, 說明乳中甲醛主要以結合態形式存在, 這與對其他食品中甲醛的存在方式研究相吻合[26-28]。同時發現, 游離態與可逆結合態甲醛的總量為87%左右, 不可逆結合態無法檢測, 即本法回收率為87%, 而陳靜等人用HPLC法檢測乳甲醛時發現甲醛的回收率約為87%[13], 二者結果一致。

2.2 乳中甲醛存在狀態的影響因素

2.2.1 溫度對乳中甲醛存在狀態的影響

分別對牛乳進行不同溫度處理, 測定不同態甲醛含量, 并記錄數據, 結果見表2、圖1。

表2 溫度對甲醛狀態的影響

圖1 不同加熱溫度對甲醛狀態的影響

由表2可知, 在室溫和冷藏狀態下, 乳中甲醛存在狀態無明顯變化（配對T檢驗的P＞0.05）, 游離態甲醛含量穩定在30%左右, 可逆結合態甲醛約占56%, 結合態甲醛含量為70%左右。但將乳樣進行水浴加熱時, 乳中甲醛狀態有明顯變化。如圖1所示, 熱處理會明顯影響甲醛的存在狀態（單因素oneway-ANOVA的P＜0.05）。在加熱溫度30～100℃, 隨溫度的升高, 乳中游離態甲醛含量由31.89%增加至51.57%, 可逆結合態甲醛含量由56.62%減少至39.87%；其中在溫度為40℃與70℃時, 游離態甲醛和可逆結合態甲醛的含量變化比較顯著, 在水浴溫度40℃時, 游離態甲醛檢出量增至37.35%, 可逆結合態甲醛含量減至52.06%；在水浴溫度為70℃時, 游離態甲醛的含量高于可逆結合態甲醛達到48.58%。經計算, 加熱后不可逆態甲醛占比由13%下降到9%左右。熱處理對甲醛的存在狀態的影響可能是由于加熱使部分結合態甲醛的結合鍵斷裂或產生新的甲醛所致[24]。若用超濾離心處理乳樣品測定甲醛含量時需要考慮樣品加熱處理的影響, TCA沉淀乳蛋白測得的是游離態與可逆結合態甲醛含量的總和, 可不考慮樣品的加熱處理, 對檢測結果的影響不大。

2.2.2 時間對乳中甲醛存在狀態的影響

結合2.2.1的條件設置, 在不同溫度下放置不同時間后測定乳樣中的游離態和可逆結合態甲醛含量, 結果見圖2。

由圖2（a)可知, 在室溫和冷藏條件下, 乳中游離態和結合態甲醛含量隨時間延長無明顯變化。在24 h內對不同狀態甲醛含量進行檢測, 游離態甲醛含量為28.80%～31.06%, 可逆結合態甲醛含量為56.52%～57.45%, 這說明室溫和冷藏條件下乳中甲醛的存在狀態比較穩定。由圖2（b)可知, 對乳樣進行水浴加熱時, 隨著時間變化乳中甲醛狀態有明顯變化。在加熱溫度為40℃時, 隨水浴加熱時間的延長, 游離態甲醛含量由34.05%增多至40.44%, 可逆結合態甲醛含量隨之相應減少至51.21%。經過100 min的加熱后, 甲醛狀態仍不穩定, 但由于繼續加熱乳樣會產生其它顯色反應, 干擾甲醛的測定, 因此不再進行檢測。在溫度為70℃時, 甲醛狀態隨時間的變化較40℃更為明顯, 在加熱至80 min后, 乳中甲醛狀態基本保持不變, 其中游離態甲醛50.13%, 可逆結合態甲醛41.94%, 這可能與乳成分與甲醛的結合相關。

圖2 不同時間對甲醛狀態的影響

2.3 乳成分與甲醛的結合

乳糖和蛋白質是主要的乳成分, 分別配制與乳中乳糖、酪蛋白、乳清蛋白含量相同的溶液, 加入甲醛, 于室溫下放置1、4、8、12、24、36、48 h后, 乙酰丙酮法測定游離態甲醛的含量, 計算結合態甲醛含量, 結果見圖3、圖4。

圖4 乳蛋白與甲醛結合的程度

牛乳蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白組成, 其中乳清蛋白包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白以及其他幾種微量蛋白。甲醛等醛類物質含有羰基極性基團, 可與氨基、羥基等多數基團進行結合。由圖3、4可見, 與乳糖結合的甲醛占比4.02%～4.43%, 隨著時間變化, 甲醛狀態幾乎不變。這說明在模擬的乳糖-甲醛體系中, 大部分甲醛以游離態形式存在, 即甲醛和乳糖結合極少。酪蛋白與甲醛的結合程度為45.75%～45.96%, 隨著時間的延長, 結合狀態較穩定；乳清蛋白與甲醛的結合程度14.22%～14.63%, 隨著時間的延長, 結合狀態亦沒有明顯變化。乳蛋白富含羥基、氨基等, 暴露在甲醛中會立即反應, 形成甲醛-蛋白質復合物, 而熱處理會破壞甲醛和蛋白質之間的結合鍵或者產生新的甲醛[29-30]。有研究表明酪蛋白有很強的熱穩定性, 一般的熱處理不會導致其變性。乳清蛋白的熱穩定性差, 40℃的熱處理即可使其開始變性[29]。經40℃熱處理后乳中游離態甲醛含量增加, 這可能是由于乳清蛋白在40℃時開始變性, 甲醛與之結合的鍵隨之斷裂, 也可能是由于與甲醛結合的其他物質熱穩定性較差, 在此溫度下出現變性[30]。當熱處理溫度為70℃時, 游離態甲醛比例更大, 可能是由于乳清蛋白或其他與甲醛結合的物質變性速度迅速加快, 使得更多可逆結合態甲醛轉變為游離態。

圖3 乳糖與甲醛結合的程度

3 結論

（1）甲醛在乳中有游離態和結合態（包括可逆結合態與非可逆結合態）兩種存在方式, 游離態甲醛含量約占30%, 可逆結合態甲醛約占56.5%, 不可逆結合態甲醛約占13.5%, 結合態甲醛含量約占70%, 說明乳中甲醛主要以結合態形式存在。

（2）溫度會影響乳中甲醛的存在狀態, 未經任何熱處理或經冷藏的牛乳樣品中游離態甲醛的含量為28.7%～31%, 室溫(25℃)與冷藏條件（4℃）下, 乳中甲醛存在狀態無明顯變化, 游離態甲醛含量穩定在28.80%～31.06%, 可逆結合態甲醛約占56.52%～57.45%；加熱溫度由30℃上升到100℃甲醛的存在狀態有顯著變化, 使游離態甲醛從37.35%上升到51.57%, 可逆結合態甲醛含量由52.06%降低到39.87%。不同溫度下, 時間對甲醛存在狀態影響不一。室溫(25℃)與冷藏條件（4℃）下, 乳中甲醛的存在狀態比較穩定, 反應時間延長也未有明顯變化。在加熱溫度為30～100℃時, 隨加熱時間的延長, 乳中游離態甲醛含量由31.89%增加至51.57%, 可逆結合態甲醛含量由56.62%減少至39.87%, 其中在加熱溫度為40℃及70℃時, 甲醛狀態隨時間的變化尤為顯著。乳成分對甲醛存在狀態也有影響, 主要是乳蛋白與甲醛結合, 其中與酪蛋白結合占45.75%～45.96%, 與乳清蛋白結合占14.22%～14.63%。