母乳低聚糖檢測方法的研究進展

楊軼涵, 喬為倉, 張明輝, 姜鐵民, 李瑩, 胡聚峰, 余曉雯, 陳歷俊

（1.東北農業大學食品學院, 哈爾濱 150030；2.北京三元食品股份有限公司國家母嬰乳品健康工程技術研究中心北京市乳品工程技術研究中心母乳研究技術創新中心北京 100163）

0 引言

母乳是嬰兒生命早期階段營養的唯一來源。在母乳中, 母乳低聚糖（Human milk oligosaccharide,HMO）是僅次于乳糖和脂肪的第三大固體成分。目前許多研究表明, 母乳低聚糖對人體健康有著許多有利的影響。它可以促進有益菌的生長, 抑制病原菌的繁殖；可以直接調節腸道上皮細胞, 誘導其分化和凋亡, 并具有預防壞死性小腸結腸炎、免疫細胞調節和抗病毒等功能[1]。母乳低聚糖從組成結構來看可能有上千種, 但目前分離出來的只有兩百種左右, 確定結構和名稱的HMO只有157種[2]。母乳低聚糖的檢測, 現階段大部分還是對已有標品的HMO進行定性定量檢測, 但對于檢測母乳樣本中HMO種類的高通量定性檢測仍是一個需要攻克的難題, 所以母乳低聚糖的分離檢測仍有較大的挑戰。

1 母乳低聚糖的結構

在母乳中, HMO是3-10個共價連接的單糖的短鏈聚合物, 是僅次于乳糖和脂肪的第三大固體成分[3]。母乳低聚糖由半乳糖（galactose,Gal）, 葡萄糖（glucose,Glc）, N-乙酰氨基葡萄糖（(N-acety lglucosamine,GlcNAc）, 巖藻糖（fucose,Fuc）和唾液酸（sialic acid, Sia）5種基礎單糖所組成[4]。其中唾液酸在母乳中存在形式是N-乙酰神經氨酸（Neu5Ac）。HMO通常根據其化學電荷可分為兩類：不含電荷的單糖（Glu, Gal, GlcNAc, Fuc）組成的中性HMO和帶有N-乙酰神經氨酸（Neu5Ac）負電荷殘基的酸性HMO。唾液酸化的HMO占總HMO的12%～14%, 中性HMO可進一步分為巖藻糖基化HMO和非巖藻糖基化HMO。其中巖藻糖基化的HMO占總HMO的35%～50%, 非巖藻糖基化的HMO占總HMO的42%～55%[5]。

所有的HMO在其還原端都帶有乳糖[6]。在酶的作用下, 以β-1,3或β-1,6糖苷鍵連接乳糖-N-二糖或N-乙酰氨基乳糖延展母乳低聚糖的核心結構, 如圖1所示。在核心結構的基礎上, 糖鏈可以繼續延伸或進行巖藻糖基化和唾液酸化。α-1,2糖苷鍵連接Gal末端將乳糖巖藻糖基化形成2’-巖藻糖乳糖（2'-Fucosyllactose,2′-FL）, 或者以α-1,3糖苷鍵連接還原末端Glc巖藻糖基化形成3-巖藻糖乳糖（3-Fucosyllactose,3′-FL）。另外, 在α-2,3或α-2,6糖苷鍵連接Gal末端將乳糖唾液酸化, 分別生成3’唾液酸乳糖（3'-Sialyllactose,3′-SL）和6’唾液酸乳糖（6'-Sialyllactose,6′-SL）[7]。復雜低聚糖的乳糖部分和聚乳糖胺區部分都在α-2,3和α-2,6位唾液酸化, 同時也能在α-1,2、α-1,3和/或α-1,4位巖藻糖基化。

圖1 母乳低聚糖的核心結構

2 母乳低聚糖含量的影響因素

母乳低聚糖存在的種類和含量會因地區、遺傳、泌乳階段等因素的影響而發生變化[8]。有研究表明78%的中國母親的母乳中分泌2′-FL, 而菲律賓僅有46%的母乳中含有2′-FL。瑞典母親母乳中的3’-FL的是岡比亞農村母親母乳中3′-FL濃度的0.4倍, 瑞典母親母乳中的二唾液酰乳酸-N-四糖(Disialyllacto-Ntetraose,DSLNT)濃度在216～614 nmol/mL之間, 而岡比亞農村母親母乳中DSLNT的濃度在668～870 nmol/mL之間變化[9]。在整個母乳喂養期間, HMO的質量濃度也會根據哺乳階段而發生變化：初乳中20～24 g/L, 成熟乳中12～14 g/L。母乳中HMO的組成也與Lewis血型有著密不可分的關系。這主要是巖藻糖基轉移酶FUT2（Se基因）和巖藻糖基轉移酶FUT3（Le基因）決定的[10]。根據FUT2和FUT3巖藻糖基轉移酶的表達情況, HMO分布可以分為4組：Lewis陽性分泌型（Se+Le+）、Lewis陽性非分泌型（Se-Le+）、Lewis陰性分泌型（Se+Le-）和Lewis陰性非分泌型（Se-Le-）[11]。FUT2以α1-2糖苷鍵將Fuc連接至Gal末端。FUT3以α1-4糖苷鍵將Fuc與I型鏈亞末端的GlcNAc連接起來, 從而在分泌型母乳中產生Lewis b抗原, 而在非分泌型母乳中產生Lewis a抗原。2′-FL和乳糖-N-巖藻五糖（Lacto-N-fucopentaose I,LNFP I）是分泌型母乳中含量最高的HMO。相反, 在FUT2不表達的非分泌型母乳中不存在這兩種HMO[12]。

3 母乳低聚糖的功能

母乳低聚糖具有促進大腦發育、調節胃腸道菌群、抗病毒、預防壞死性小腸結腸炎和上皮細胞和免疫細胞調節等作用。

母乳低聚糖與腦健康息息相關。有研究發現：2’-FL可減少腦梗塞, 神經和運動功能障礙的風險, 增加體內腦源性神經營養因子的表達。并有助于中風后大腦的神經修復[13]。

嬰兒腸道菌群的定植起始于母體子宮內的階段, 隨后分娩方式, 母乳喂養方式, 斷奶方式, 遺傳因素, 環境因素和藥物因素等會影響嬰兒第一年腸道菌群的定植[14]。HMO可以不被人體胃液所破壞, 也不會被胃腸道消化酶水解, 可以直到大腸, 刺激有益微生物（主要是雙歧桿菌）的生長并抑制有害菌的生長。HMO會改善嬰兒腸道中的微生物種群。研究表明, 通常在母乳喂養的嬰兒中定殖的擬桿菌屬和雙歧桿菌屬能夠有效地利用HMO作為碳源[15]。雙歧桿菌在利用HMO時, 會產生大量的短鏈脂肪酸, 從而降低腸道內的pH值, 抑制病原菌的生長[16]。

新生兒的免疫系統尚未發育成熟, 母乳喂養可以一定程度上降低嬰兒感染疾病的發生率。HMO不僅可以促進免疫系統的成熟, 刺激上皮細胞的免疫反應和成熟, 保護嬰兒免受病毒的感染[17], 還可以與胃腸道上皮細胞以及黏膜和全身免疫細胞相互作用, 調節免疫功能或直接調節免疫反應[18]。壞死性小腸結腸炎（Necrotizing enterocolitis,NEC）是早產兒常見的一種疾病, 是早產兒死亡的重要原因。HMO對新生兒患NEC有較明顯的緩解效果[19]。

4 母乳低聚糖的檢測

母乳中除了HMO之外, 還含有大量的脂肪、蛋白質和糖胺聚糖等生物活性物質。所以在對HMO進行檢測時, 這些生物活性物質是必須要被去除的雜質, 但HMO的分離純化有許多的困難。首先, 母乳低聚糖中含有較多的乳糖, 乳糖的存在會影響后續HMO的分析檢測。因此在對HMO進行檢測前均需先進行樣品前處理, 之后再對其進行定性、定量的分析。其次HMO種類繁多, 存在大量的同分異構體, 容易發生共同洗脫的現象不易分離[20]；并且沒有內在的發色基團, 使其在儀器上的靈敏度較低, 這些因素都會使得HMO的分離與檢測有著較大的困難[21-22]。

4.1 母乳低聚糖的分離方法

在對HMO進行分析測定之前, 需要對樣本進行前處理, 即將母乳低聚糖與母乳中的脂質、蛋白質等其他成分進行分離。脂質可以通過低溫高速離心的方式除去, 除蛋白的方法有以下幾種, 如表2所示。有機溶劑可以使蛋白質變性沉淀, 進而去除蛋白獲得低聚糖, 但易造成母乳低聚糖的損失。超濾法是將較高分子量的成分保留在膜的一側, 從而將所需成分從液體中分離出來, 是膜分離的方法之一。超濾操作簡單, 且不需要任何的化學試劑。

在分離HMO時, 乳糖也是不可忽視的成分。在母乳中, 乳糖的含量大概是HMO的7倍。對母乳低聚糖進行檢測的同時, 乳糖會影響HMO的分析結果, 因此在某些實驗中乳糖的去除也是不可忽視的。實驗室中通常采用C18固相萃取樹脂和多孔石墨化碳(PGC)來對HMO和乳糖進行分離, 兩者均利用了碳水化合物的親水性[28]。在固相萃取過程中, 低聚糖被吸附在固相萃取柱中, 而其他物質則可以順利通過吸附劑, 從而達到分離純化的目的。但用此方法對低聚糖進行分離時, 易造成低聚糖的大量損失[29]。葡聚糖凝膠層析也是分離純化HMO的有效方法之一, HMO按照分子量的大小依次被洗脫出來。但隨著洗脫時間的增加, 洗脫下來的乳糖含量會逐漸增多, 因此該方法需嚴格控制洗脫時間[30]。除此之外, 還可以通過離子交換柱層析法和活性炭柱層析法等方法來去除乳糖[31-32]。

表1 母乳除蛋白的主要方式

4.2 母乳低聚糖的檢測方法

目前母乳低聚糖的檢測可以通過毛細管電泳、高效液相色譜、高效陰離子交換色譜、親水相互作用液相色譜、液相色譜-質譜聯用和核磁共振等技術來實現。

4.2.1 毛細管電泳

毛細管電泳（Capillary electrophoresis,CE）在外加電場的作用下分離樣品, 首先被分離洗脫出來的是帶正電荷的物質, 然后是中性物質, 最后是帶負電的物質。毛細管電泳時同分異構體共同洗脫的情況比較常見, 因此分離樣品時可以通過使用較長的毛細管色譜柱或者在合理的時間范圍內使用不同的分離緩沖液和凝膠來提高分析物各組分之間的分離度[33]。Bao Y等人通過CE-UV在205 nm的紫外吸光度處, 在35 min內定量檢測母乳中12種主要的HMO, 來檢測不同泌乳階段、不同母親母乳中的低聚糖含量變化[34]。隨后Galeotti F等人在此方法的基礎上改進了實驗條件, 在乳糖含量較高的情況下, 分離中性HMO和酸性HMO, 并在254 nm的紫外吸光度處, 對17種中性和酸性HMO標準品進行分離和檢測[35]。此后Albrecht S等人首次使用毛細管電泳與電噴霧質譜（Electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS）聯用的方法, 對母乳和嬰兒糞便中的低聚糖進行分離和測定, 得出HMO經在腸胃道的消化后的轉化產物[36]。并且CEESI-MS/MS這種方法, 可以用aminoxyTMT衍生試劑來標記中性和唾液酸化的HMO, 提高定量分析的準確性和同分異構體的分辨率[37]。

CE除了可以檢測HMO之外, 還可以研究HMO與其他碳水化合物之間的相互作用。Nakajima等人用毛細管親和電泳法（CAE）研究了24種HMO和PAI、RCA120、SBA、WGA、UEA-I和AAL等6種凝集素之間的相互作用, 并基于實驗結果, 構建了可以用來確認非還原末端單糖的數據庫。并且可以利用此庫, 通過凝集素的組合來表征中性HMO[38]。

4.2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法（High-performance liquid chromatography,HPLC）可用于對于母乳低聚糖的定量檢測和結構表征。但由于母乳低聚糖的紫外線吸收能力差, 缺乏熒光特性, 因此高效液相色譜法在搭配熒光探測器時, 需要對其進行衍生化, 增加檢測的靈敏度。常用的衍生試劑有：2-氨基苯甲酰胺（2-Aminobenzamide,2-AB）, 2-氨基苯甲酸（2-Aminobenzoic acid,2-AA）和2-氨基吖啶酮（2-Aminoacridone,2-AMAC）等[39]。但該方法需要通過萃取或離子交換色譜等方法來去除多余的衍生試劑, 以避免其對于分析的干擾。高效液相色譜除了可以搭配熒光探測檢測器外, 還可以搭配紫外-可見光檢測器、示差折光檢測器和蒸發光散射檢測器等。Christensen等人開發了一種高效液相色譜-折射率檢測的（HPLC-RI）方法, 可以快速地在19 min內對全脂奶粉、嬰幼兒配方奶粉和谷物棒中的2′-FL和3′-FL的定性定量的檢測[40]。楊新磊等人通過超高效液相色譜與蒸發光散射檢測器聯用, 通過乳糖的標準曲線就可以完成糖漿中不同聚合度半乳糖的定量檢測[41]。

4.2.3 高效陰離子交換色譜法

離子色譜（Ion Chromatography）是分析陰陽離子的一種液相色譜法。它的原理是根據被測分析物的可解離性與固定相表面帶電荷的功能基團相互作用, 使待分析的物質保留在固定相上, 不同的離子因與固定相作用力的不同而得以分離的液相色譜方法[42]。該方法檢測準確, 分析速度快, 靈敏度高, 無需衍生, 并且可以同時測定多個待分析物質的量, 避免了HMO因衍生化而產生的誤差, 適用于復雜HMO混合物的定性和定量分析[43-44]。

高效陰離子交換色譜（High-pH anion-exchange chromatography,HPAEC）可以用于對HMO進行分離, 常與脈沖安培檢測器（Pulsed amperometric dector,PAD）進行聯用。PAD檢測靈敏度較高, 但它只能在堿性條件下使用, 因此通常情況下, 離子色譜檢測時流動相是NaOH和NaOAc[45]。1996年Thurl等人首次用HPAEC-PAD對14種中性HMO和6種酸性HMO進行定量加檢測[46]。此后, 許多研究實驗都用高效陰離子交換色譜法來對HMO進行檢測研究：朱偉等人用HPAEC-PAD測定嬰幼兒配方奶粉中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖等8種功能性低聚糖含量[47]。Coppa G V等人則用該檢測方法定量測定18位母親在哺乳期三個月內21種母乳低聚糖在不同階段的動態變化, 發現所有的HMO在產后第4天的含量最高, 而到了第30天時則減少了20%[48]。

4.2.4 親水相互作用液相色譜法

親水相互作用液相色譜法（Hydrophilic interaction chromatography,HILIC）的保留分配機制與氫鍵作用、偶極作用和靜電作用等多種效應密切相關。HILIC是分析HMO常用的分析方法之一, 有時也會被稱為正相色譜法。該方法非常適合分離較大質量的HMO和HMO的異構體, 但對相似的質量較小的碳水化合物分析效果不佳。Sean等通過親水相互作用液相色譜與熒光檢測(HILIC-FLD)將2′-FL和乳糖基-N-新四糖（Lacto-N-neotetraose,LNnT）分離開來, 對這兩種低聚糖進行定性定量的檢測。隨后將該方法與HPAEC-PAD進行比較, 應用到商業工廠樣品中, 發現FLD在分離低聚糖時, 破壞了產品配方基質間的相互作用, 使其分離效果好于HPEAC-PAD[49]。

4.2.5 液相色譜-質譜聯用法

液相色譜可以與檢測結構信息的MS檢測系統聯用, 其原理是當樣品通過色譜柱后, 各組分之間實現分離, 待分離組分到達離子源時, 將待測組分進行分子離子破碎, 產生大量碎片并對其進行分析。該方法不僅可以通過峰面積對其進行定量分析, 還可以通過質譜碎片進行結構的分析以及定性的檢測。該方法縮短了分析時間, 是目前分析低聚糖的重要手段之一。Wu等人通過液相色譜-飛行時間質譜法產生的診斷峰和特征碎片來區分同分異構體, 建立了一個30個SHMO的數據庫和一個含有45個中性HMO的數據庫[50-51]。張文源等人用液相色譜-質譜法成功分離出LNFPⅠ和LNFPⅢ；LSTa、LSTb和LSTc；2′-FL和3′-FL；3′-SL和6′-SL等4對同分異構體, 并成功定量測量了12種HMO[52]。Tedesco等人開發了一種HPAEC與質譜檢測儀聯用的方法來測定蜂蜜樣品中碳水化合物組成, 并用該方法成功地對7個單糖、8個二糖、4個三糖和1個四糖進行了定量檢測[53]。Rudd P M用HILIC-HPLC和外聚糖苷酶消化法鑒定了牛初乳中33種不同的結構牛乳低聚糖。并結合MS, 識別了含有Neu5Gc的4種唾液酸化結構的牛乳低聚糖[54]。Fong B等人也在此方法的基礎上, 測定了成熟牛乳、牛初乳和嬰兒配方奶粉中3′-SL, 6′-SL, 3′-SLN、6′-SLN, 二唾液酸乳糖(DSL)和N-乙酰半乳糖胺基乳糖(GNL)等6種HMO的含量[55]。美國學者Remoroza等人通過親水相互作用液相色譜-電噴霧電離串聯質譜法, 建立了1個含有74種HMO的質譜參考圖庫[56]。Yan等人則是將固相萃取、親水相互作用色譜法和質譜法結合起來, 測定了1周至4個月期間酸性母乳低聚糖的含量變化[57]。

4.2.6 核磁共振技術

核磁共振技術（NMR）的原理是低能態的原子核磁矩在恒定場強和交變場強的相互作用下吸收了由交變場強提供的能量后, 躍遷至高能態的原子核磁矩, 從而產生核磁共振信號。NMR技術常應用在HMO結構的分析, 目前研究應用比較廣泛的是1H NMR。Van等人提出了一種1H NMR快速分析的方法, 該方法可識別α1-2、α1-3和α1-4糖苷鍵連接的巖藻糖殘基在HMO樣品中是否存在, 并用該方法對36種HMO樣本進行分析, 成功將36個樣本分成Lewis陽性分泌型；Lewis陽性非分泌型；Lewis陰性分泌型和Lewis陰性非分泌型四組[58]。目前1H NMR也可用于檢測尿液和糞便樣品中的HMO, 來分析嬰兒腸道中HMO的代謝特征, 而且現在也可以運用多維核磁共振光譜對HMO進行分析[59]。

4.2.7 其他

還有一些其他的方法也可用于分析HMO。劉世偉等人通過二氧化碳超臨界流體色譜法分離了18種母乳低聚糖復雜的同分異構體[60]。Mernie等人通過薄層色譜-質譜法對25種HMO進行快速地分離鑒定, 并通過該方法對不同時期的母乳低聚糖進行了定量檢測[61]。

目前可以就用來檢測HMO的方法眾多, 但每種檢測方法均有利弊, 其效率和準確性還有待進一步地提高, 如表2所示。現階段HMO的定量檢測較為簡單, 但HMO的高通量檢測仍是需要攻克的難題。

表2 母乳低聚糖主要檢測方法及其優缺點

5 結論

母乳中可能含有上千種低聚糖, 但確定名稱和結構的HMO有157種。而且由于地區、泌乳階段、遺傳等因素的影響, HMO種類和含量會發生變化。目前可以通過毛細管電泳、液相色譜或液相色譜-質譜等方法對HMO進行定性定量的檢測。但目前檢測大量樣品及多種HMO的高通量定性檢測還有待進一步的發展。

目前國際上添加到嬰幼兒配方奶粉中的HMO主要有：2′-FL、LNnT、3′-GL、3′-SL和6′-SL等。但是我國目前嬰幼兒配方奶粉中允許添加的低聚糖只有低聚半乳糖、低聚果糖、多聚果糖、棉子糖和聚葡萄糖等, 所以我國第五代嬰幼兒配方奶粉的發展目標之一就是優化碳水化合物成分。開發出對樣品中HMO進行高通量定性檢測的方法, 并與現有的母乳低聚糖定量檢測方法結合, 去檢測不同地區不同泌乳階段的母乳, 總結HMO的種類和含量的變化規律。這將以便于以后對0～6個月、6～12個月和12～24個月不同階段的嬰幼兒配方奶粉中HMO種類和含量的添加提供依據, 有利于配制出與母乳最為接近的嬰幼兒配方奶粉。