UHPLC-Q-Orbitrap MS/MS檢測益生菌來源的3種吲哚衍生物

周冰洋, 呂嘉櫪, 吳定燕, 張明新, 巨瑞, 王維波, 賈瑋, 魯曦

（陜西科技大學 食品與生物工程學院, 西安 710000）

0 引言

色氨酸是人體必需的氨基酸。膳食在生物體內僅有5%左右的色氨酸會被吸收利用[1], 相當比例未被吸收的色氨酸會被腸道微生物利用產生多種吲哚衍生物[2-5], 發揮調節宿主免疫、改變與宿主相互作用的功能[6]。羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri, L.reuteri）作為一種益生菌, 廣泛存在于哺乳動物的腸道中, 能夠抑制腸道病原菌生長, 改善宿主腸道微環境[7]。

目前對吲哚衍生物檢測方法的研究主要集中于植物來源[8]和細胞來源[9-10], 且目前檢測吲哚衍生物的方法對樣品前處理要求嚴格。微生物培養基成分復雜, 干擾物質較多且益生菌源吲哚衍生物產量較低。而UHPLC-Q-Orbitrap MS/MS將高選擇性的四極桿與軌道離子阱高分辨準確質量數測量技術有機結合[11-12], 具有樣品前處理凈化能力要求低、高效、方便等優點[13]。

建立益生菌源吲哚衍生物定量方法, 不僅有助于益生菌菌株篩選, 也為進一步深入研究吲哚衍生物的生理功能和作用機制奠定基礎[10,14-16]。本研究基于UPLC-Q-Orbitrap MS/MS, 建立能夠同時檢測益生菌（L.reuteri）培養上清液中吲哚-3-乳酸（ILA）、吲哚-3-乙酸（IAA）和吲哚-3-丁酸（IBA）的技術方法, 并對7株L.reuteri的吲哚衍生物表達量進行定量篩選。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS肉湯培養基, 北京奧博星生物技術有限責任公司；M9培養基, 天津市科密歐化學試劑有限公司；色氨酸和吲哚-3-乳酸（純度≥99%）, 上海麥克林生化科技有限公司；無水硫酸鈉, 天津市天力化學試劑有限公司；PBS, 中暉赫彩；吲哚-3-乙酸（純度≥99%）, MYM生物技術公司；吲哚-3-丁酸（純度≥99%）, 國藥集團化學試劑公司；乙酸乙酯、甲醇、乙腈、醋酸銨（均為色譜純）, 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

Q-Exactive超高效液相色譜—四極桿—靜電場軌道離子阱串聯質譜, 美國Thermo Fisher Scientific公司；配備Syringe自動取樣器系統、電噴霧離子源；HC-3018R高速冷凍離心機, 安徽中科中佳科學儀器有限公司；VORTEX Genius 3型渦旋振蕩器, 德國IKA公司；分析天平, 德國Sartorius BSA224S；DH-360恒溫培養箱, 北京科偉永興儀器有限公司；RE-2000B旋轉蒸發儀, 上海亞榮生化儀器廠；Milli-Q Integral型純水儀, 美國Millipore公司。

1.3 菌株

羅伊氏乳桿菌：L.reuteri GH211-4、L.reuteri GH319-13、L.reuteri GH812-16、L.reuteri GH812-17、L.reuteri GH329-22、L.reuteri DSM 17938和L.reuteri GH226-12均由陜西科技大學實驗室保存。

1.4 方法

1.4.1 標準溶液的配制

用甲醇配制吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丁酸的1 mg/mL混合標準品母液, 置于-20℃冰箱中保存。取一定量的混合標準品母液, 用改良M9培養基, 即M9培養基+0.6μmol/L色氨酸, 稀釋成1000、500、100、20、4 ng/mL工作液。

1.4.2 色譜條件

色譜柱為Hypersil Gold C18反相色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.7μm）, 流動相A為10 mmol/L醋酸銨水, B為10 mmol/L醋酸銨和乙腈；進樣體積為5μL, 流速為300μL/min, 柱溫為30℃, 梯度洗脫程序如表1所示。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.4.3 質譜條件

電噴霧離子源, 質量分析器為Orbitrap, 掃描模式采用正離子掃描模式, 數據依賴性掃描Full MSdd MS2, 噴霧電壓3.5 kV。電噴霧電離源(ESI)參數為：鞘氣體流量為40 arb；輔助氣體流量為-10 arb；毛細管溫度為320℃；全掃描和二級掃描分辨率分別為70 000和17 500；質量采集范圍為m/z 100～1 500, 3種吲哚衍生物的具體質譜信息如表2所示。

表2 3種吲哚衍生物的質譜信息

1.4.4 L.reuteri發酵上清中吲哚衍生物的檢測

1.4.4.1 L.reuteri發酵上清液的培養

用一次性無菌接種環分別從MRS瓊脂平板上挑取單個L.reuteri菌落接種到5 mL新鮮MRS肉湯培養基中, 37℃過夜厭氧培養, 將活化的L.reuteri菌液搖勻, 按1 %的接種量接種到5 mL MRS肉湯培養基37℃, 厭氧培養12 h后, 12 000 rpm離心5 min收集菌體, 用PBS洗滌菌體沉淀, 12 000 rpm離心5 min棄上清。將收集到的7株L.reuteri菌體沉淀2份分別添加到7管5 mL新鮮M9培養基和改良M9培養基（+0.6μmol/L色氨酸）中培養48 h, 12 000 rpm離心5 min取上清液待用。

1.4.4.2樣品前處理

取L.reuteri發酵上清液5 mL, 加200μL的甲醇, 搖勻, 用PBS緩沖液調節pH至6-7。加入2.5 mL乙酸乙酯萃取, 劇烈震蕩30 s, 靜置3 min, 重復3次。收集乙酸乙酯層液體于15 mL離心管中, 加入少量無水硫酸鈉干燥5 min, 氮氣常溫吹干, 用150μL甲醇復溶后上機檢測。

1.4.4.3基于3種吲哚衍生物產量篩選L.reuteri

將所選7株L.reuteri分別在M9和改良M9培養基中厭氧培養, 經1.4.4.2前處理后上機檢測, 利用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道離子阱串聯質譜測定樣品與標準品相同質荷比和保留時間的峰面積, 根據測定的標準曲線求得樣品中3種吲哚衍生物的含量。基于3種吲哚衍生物的含量篩選出產量最高的L.reuteri。

2 結果與討論

2.1 標準曲線及線性范圍

將吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丁酸的混合標準品1 000、500、100、20、4 ng/mL 5個工作液經1.4.4.2樣品前處理后, 按照1.4中的色譜和質譜條件上機檢測, 待測混合標準品中3個吲哚衍生物都可以有效分離。以縱坐標為標準品峰面積、橫坐標為濃度（ng/mL）繪制標準曲線, 得到吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丁酸的擬合線性方程。結果發現, 3種吲哚衍生物的標準曲線線性關系良好, 相關系數R2＞0.99（圖1～3、表3）。

圖1 吲哚-3-乳酸標準曲線

圖2 吲哚-3-乙酸標準曲線

圖3 吲哚-3-丁酸標準曲線

表3 吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丁酸線性方程、相關系數及線性范圍

2.2 方法檢出限及定量限

本研究方法以信噪比（S/N）≥3的標準品濃度為檢出限（Limits of detection,, LOD）, 以信噪比（S/N）≥10的標準品濃度為定量限（Limits of quantitation, LOQ）。吲哚-3-丁酸的檢出限和定量限最低分別為1.0和3.2 ng/mL, 其次是吲哚-3-乙酸分別是2.2和7.2 ng/mL, 吲哚-3-乳酸的檢出限和定量限分別是2.4和8.0 ng/mL, 如表4所示。

表4 3種吲哚衍生物的檢出限和定量限

2.3 方法準確度及精密度

在改良M9培養基中分別添加終濃度為500、100、20 ng/mL的吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丁酸混合標準品溶液, 每個濃度設3個平行。將改良M9培養基及加標培養基, 按1.4.4.2前處理方法處理之后上機檢測。如表5所示, 該方法測量回收率在90%～110%之間, 且相對標準偏差RSD＜5%, 數據表明測量方法精確度良好。

表5 改良M9培養基加標回收率及相對標準偏差

2.4 樣品測定

將L.reuteri GH211-4、L.reuteri GH319-13、L.reuteri GH812-16、L.reuteri GH812-17、L.reuteri GH329-22、L.reuteri DSM 17938、L.reuteri GH224-12等7株羅伊氏乳桿菌, 按照1.4.4方法制備L.reuteri發酵上清液, 對L.reuteri發酵上清液中吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸3種吲哚衍生物的含量進行測定。色譜圖如圖4～6所示：其中吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丁酸的特征性碎片離子分別為m/z 206.0811［M+H］+、m/z 176.0706［M+H］+和m/z 204.1019［M+H］+。由特征性碎片離子峰面積定量得出的吲哚衍生物分析結果如表6所示。由表6可以看出, L.reuteri對色氨酸的代謝能力存在菌株差異, 而且外源色氨酸的添加可以顯著增加L.reuteri發酵上清液中3種吲哚衍生物的含量。L.reuteri能夠代謝色氨酸產生吲哚-3-乳酸, 這與Cervantes-Barragan等人[17]的研究結果一致, 而在培養基中外源添加色氨酸可以增加吲哚-3-乙酸等吲哚衍生物的產量, 與劉悅[10]等人的研究結果相一致。

表6 不同L.reuteri菌株經過M9培養基是否外源添加色氨酸培養48 h后, 發酵上清液中吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸的含量

圖5 UHPLC-Q-Orbitrap MS/MS分析L.reuteri GH226-12發酵上清液和吲哚-3-乙酸標準品檢測結果

圖6 UHPLC-Q-Orbitrap MS/MS分析L.reuteri GH226-12發酵上清液和吲哚-3-丁酸標準品檢測結果

2.5 基于3種吲哚衍生物的產量L.reuteri菌株的篩選

根據表6結果顯示, 在外源添加0.6μmol/L色氨酸后, 各株菌株吲哚衍生物產量都發生顯著提高, 其中GH226-12號樣品中3種吲哚衍生物濃度均顯著高于其它組, 其中吲哚-3-乳酸濃度為241.12±2.19 ng/mL、吲哚-3-乙酸為109.66±1.14 ng/mL、吲哚-3-丁酸為14.91±1.32 ng/mL。以上數據提示, GH226-12號菌株為此次備選的7株L.reuteri中3種吲哚衍生物產量最高的一株。L.reuteri作為人體腸道中廣泛存在的一種益生菌, 產生的吲哚衍生物具有抗炎作用[18]、調節宿主免疫、改善腸上皮屏障等多種益生功能。因此, 篩選出得到的吲哚衍生物產量高的L.reuteri可作為一種潛在的食物干預手段為炎癥性腸病的治療提供新思路。

3 結論

由于微生物培養基成分復雜, 干擾物質較多且吲哚衍生物產量較低, 如Cervantes-Barragan等人的研究采用1 L的益生菌發酵上清液來濃縮檢測[16], 而本研究建立的樣品前處理方法只需要5 mL上清液。上清液經簡單的離心處理, 然后用乙酸乙酯萃取、濃縮, 即可用于UHPLC-Q-Orbitrap MS/MS檢測。因此, 所建立的方法具有樣品用量少, 操作流程方便、快捷的優點。其次, 該方法回收率高, 精確度高、重現性好。而基于超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道離子阱串聯質譜技術, 成功建立了益生菌發酵上清液中吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丁酸3種吲哚衍生物的檢測方法。該方法R2＞0.99、線性范圍4～1 000 ng/mL、回收率在90%～110%之間, 且相對標準偏差在5%以內；利用該方法, 成功篩選出1株高產吲哚衍生物的羅伊氏乳桿菌, 為吲哚衍生物益生功能的研究和益生菌產品的開發奠定了技術基礎。