人參葛根植物飲料對小鼠體力疲勞的緩解作用研究

吳名草，王 晶，沈旭丹，郁 星

（江陰天江藥業(yè)有限公司，江蘇 無錫 214429）

隨著工作和生活壓力日益加大，人們經(jīng)常會產(chǎn)生疲勞感。疲勞是指機(jī)體經(jīng)超長時間或超高強(qiáng)度的體力或腦力勞動后，無法繼續(xù)保持其生理機(jī)能在特定水平或其運動強(qiáng)度在預(yù)定的強(qiáng)度[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，疲勞可被劃分為腦力、體力、病理及心理四方面的疲勞狀態(tài)。其中，體力疲勞會使機(jī)體出現(xiàn)各種生物調(diào)節(jié)和各大系統(tǒng)運行障礙，一般呈現(xiàn)出情緒低落、精神不振、記憶減退、動作遲緩、周身無力、腰膝酸軟、肌肉酸痛等癥狀，嚴(yán)重時能夠造成慢性疲勞綜合征的發(fā)生[2]。據(jù)統(tǒng)計，疲勞的發(fā)生率約為7%～45%，已成為困擾現(xiàn)代人身心健康的關(guān)鍵問題[3]。諸多因素均會導(dǎo)致體力疲勞的發(fā)生，主要發(fā)生機(jī)制可概括為三大類，分別為能量耗竭、代謝產(chǎn)物蓄積以及機(jī)體氧化應(yīng)激失衡[4]。

目前，市場上常見的抗疲勞產(chǎn)品一般通過添加咖啡因等成分發(fā)揮作用，且部分產(chǎn)品添加量都超過了人體安全極限。咖啡因只能刺激中樞神經(jīng)產(chǎn)生短時的興奮，長期服用會出現(xiàn)耐受性，且過量攝入還可能會引發(fā)心血管疾病[5]。研究顯示，部分藥食同源物質(zhì)的攝入，能促進(jìn)糖原的合成、緩解機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，加快機(jī)體清除代謝物的速度，從而表現(xiàn)出了緩解體力疲勞相關(guān)的潛力[6-10]。

根據(jù) 2003版《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》[11]的要求，本研究針對由人參、枸杞、黃精、葛根與煙酸等物質(zhì)復(fù)配而成的人參葛根植物飲料，進(jìn)行緩解體力疲勞的效果評價，為人參葛根植物飲料的應(yīng)用和推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參葛根植物飲料：江陰天江藥業(yè)有限公司；咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)值：99.8%）：北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；乳酸測定試劑盒（blood lactic acid，BLA）、糖原測定試劑盒、血尿素氮測定試劑盒（blood urea nitrogen，BUN）：南京建成生物科技公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）ELISA試劑盒、肌酸激酶（creatine kinase，CK）ELISA試劑盒：南京森貝伽生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

大小鼠抓力測定儀（YLS-13A）：濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司；疲勞轉(zhuǎn)棒儀（ZB-200）：成都開東科技有限公司；羅氏血糖儀（ACCU-Chek）：Roche Diabetes Care GmbH；多功能酶標(biāo)儀（BioTekInstruments）：美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗動物

5周齡雄性SPF級ICR小鼠：浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 動物試驗設(shè)計

60只5周齡的ICR雄性小鼠，經(jīng)過7 d的適應(yīng)期后，按每組10只隨機(jī)分為6組，具體分組見表 1。小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(23.1±0.9) ℃、相對濕度52.8%±3.0%、換氣次數(shù)為10～20次/h、光照12 h和黑夜12 h清潔干燥條件下，并能夠自由飲食、飲水。試驗方案經(jīng)江南大學(xué)實驗動物中心倫理委員會審查批準(zhǔn)（JN.No20210415i1200610）。

如表1所示，小鼠隨機(jī)分成6組，依次是灌胃無菌生理鹽水的空白組、灌胃無菌生理鹽水的試驗對照游泳組、灌胃咖啡因的咖啡因組、以及分別灌胃低、中、高劑量組人參葛根植物飲料的3組，根據(jù)分組情況和灌胃物質(zhì)要求，各組小鼠連續(xù)30 d灌胃0.02 mL/g·bw的灌胃物質(zhì)進(jìn)行干預(yù)試驗。且在第30 d時，除空白組外，其余各組均建立負(fù)重游泳運動性疲勞模型。

表1 試驗小鼠的分組及處理方式Table 1 Grouping and processing methods of experimental mice

1.4.2 小鼠轉(zhuǎn)棒持續(xù)時間的測定

小鼠轉(zhuǎn)棒試驗參考王藝博等[13]的方法，在第27 d和第28 d灌胃結(jié)束30 min后進(jìn)行轉(zhuǎn)棒試驗，前一天為轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練，記錄后一天正式試驗中各組小鼠的轉(zhuǎn)棒持續(xù)時間以評估小鼠的運動平衡性。

1.4.3 小鼠抓力的測定

小鼠抓力試驗參考 HSU等[14]的方法，在第28 d灌胃結(jié)束30 min后，測定并記錄小鼠的前肢抓力用于考察小鼠的肌肉力量。

1.4.4 小鼠負(fù)重游泳模型的建立

第30 d，灌胃結(jié)束30 min后，參考《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中緩解體力疲勞功能評價方法[11]，針對游泳組、咖啡因組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠建立負(fù)重游泳運動性疲勞模型。

1.4.5 小鼠疲勞相關(guān)指標(biāo)的測定

造模結(jié)束后，取眼球血處理后得血清。參照相應(yīng)試劑盒說明書測定血清中尿素氮、乳酸、血糖、肝糖原、肌糖原、乳酸脫氫酶、肌酸激酶的含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以GraphPad Prism 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和繪圖。數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用單因素方差分析和 Dunnett-t檢驗進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05表示顯著性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 人參葛根植物飲料對小鼠運動能力的影響

體力疲勞通常表現(xiàn)為中樞性疲勞及外周性疲勞兩種，其中，中樞性疲勞的產(chǎn)生原因為中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷，其損傷情況可以直接用行為學(xué)試驗評價。目前，評價小鼠運動能力和疲勞程度常用的方法有前肢抓力試驗和轉(zhuǎn)棒試驗。前肢抓力試驗作為評估運動后神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要指標(biāo)，常用于檢測機(jī)體的肌肉力量，能直觀反映機(jī)體的疲勞程度[15-16]。轉(zhuǎn)棒試驗是評價小鼠運動的協(xié)調(diào)性和平衡性的關(guān)鍵指標(biāo)，能反映出機(jī)體運動的持續(xù)穩(wěn)定時間從而直接反映疲勞程度[17]。

結(jié)果如圖1所示，各劑量組人參葛根植物飲料相比于空白組均能夠提高小鼠的前肢抓力、延長轉(zhuǎn)棒持續(xù)時間，且隨著劑量增加，小鼠的抓力和轉(zhuǎn)棒持續(xù)時間呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢，其中中劑量組效果最佳，達(dá)到咖啡因組小鼠的運動水平。說明人參葛根植物飲料具有減輕神經(jīng)疲勞損傷程度、提高小鼠運動能力的作用。研究顯示，小鼠抓力和轉(zhuǎn)棒時間等行為學(xué)指標(biāo)與機(jī)體運動耐力和疲勞狀態(tài)緊密相關(guān)，人參葛根植物飲料中的人參、黃精、煙酸等組分通過刺激下丘腦-垂體-腎上腺軸，抑制5-羥色胺、γ-氨基丁酸等抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，促進(jìn)多巴胺等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的合成，引起大腦皮質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)興奮度，使其釋放神經(jīng)沖動的頻率提高，從而達(dá)到延長運動時間、延緩中樞神經(jīng)疲勞的目的，這與MA等[18]、付莉慧[19]、LUO等[20]的研究結(jié)果相同。

同時，本試驗表明，人參葛根植物飲料的緩解體力疲勞效果呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，其中中劑量人參葛根植物飲料提高小鼠運動能力效果最佳。這可能是由于人參能夠雙向調(diào)節(jié)機(jī)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，小劑量人參的攝入能提高機(jī)體的興奮度，而大劑量人參的攝入會產(chǎn)生抑制效果[21]。

2.2 人參葛根植物飲料對小鼠疲勞相關(guān)生化指標(biāo)的影響

負(fù)重游泳試驗?zāi)茉黾訖C(jī)體氧化損傷水平，提高肌細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)血清中尿素和乳酸等代謝產(chǎn)物的堆積，并提高乳酸脫氫酶的活性，達(dá)到產(chǎn)生體力疲勞的目的。本試驗參考《保健食品功能評價》中緩解體力疲勞試驗方法，評估了不同試驗組小鼠在負(fù)重游泳后的相關(guān)代謝產(chǎn)物水平。

2.2.1 人參葛根植物飲料對小鼠運動后機(jī)體代謝產(chǎn)物的影響

機(jī)體尿素氮和乳酸含量為機(jī)體運動疲勞程度的衡量提供關(guān)鍵判定標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)運動量達(dá)到一定程度后，糖和脂肪代謝分解速率不足以滿足機(jī)體能量所需，此時機(jī)體開始提高蛋白質(zhì)和氨基酸分解水平，繼而引起血尿素氮含量顯著增加，機(jī)體疲勞感增強(qiáng)；而隨著疲勞程度的加重，機(jī)體氧氣量不足，為滿足機(jī)體運動需求，無氧代謝水平提高，但其在保證能量供應(yīng)的同時伴隨著乳酸的生成，造成乳酸大量堆積，產(chǎn)生肌肉疲勞現(xiàn)象[22]。

由圖 2可知，游泳組小鼠的 BUN含量（9.61 mmol/L）和BLA含量（480.7 μg/L）顯著高于空白組（P＜0.01），說明利用負(fù)重力竭游泳法成功建立了小鼠運動性疲勞模型。與游泳組相比，中劑量組和高劑量組小鼠的BLA水平顯著降低，且結(jié)果呈劑量依賴性，中劑量組小鼠的BUN含量顯著降低（P＜0.05），與咖啡組效果相近。結(jié)果表明，人參葛根植物飲料可以有效清除BUN和BLA積累，且中劑量組的效果最優(yōu)，說明人參葛根植物飲料具有良好的清除機(jī)體運動代謝產(chǎn)物的作用?？赡苁侨藚⒏鸶参镲嬃显鰪?qiáng) BLA和BUN的代謝分解，清除機(jī)體運動疲勞產(chǎn)生的氧化自由基，從而減輕體力疲勞，這與其組成成分緊密相關(guān)[18-20]。此外，試驗發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量組小鼠 3個指標(biāo)水平呈現(xiàn)劑量依賴性的興奮-抑制的趨勢，其中中劑量組效果相對較突出，與小鼠運動能力的劑量依賴性趨勢一致。

圖2 人參葛根植物飲料對運動小鼠尿素氮、乳酸的影響Fig.2 The effect of botanical beverage with ginseng extract and pueraria extract on blood urea nitrogen and blood lactic acid in exercised mice

2.2.2 人參葛根植物飲料對小鼠運動后機(jī)體能源物質(zhì)的影響

在一定程度上，機(jī)體內(nèi)糖原的存量及糖原的代謝分解情況能夠代表其抗疲勞的水平。在運動中，肌糖原首先為肌肉供應(yīng)了主要能量，隨后肝臟組織中儲備的肝糖原分解，以血糖形式運輸全身供能。因此，血糖、肝臟和肌肉中糖原水平都是與疲勞有關(guān)的重要因素，是疲勞產(chǎn)生快慢程度的直接表現(xiàn)[23]。

如圖3所示，高劑量組肝糖原含量和低、中、高劑量組肌糖原含量均顯著高于游泳組，且各劑量組的肝糖原和肌糖原水平呈劑量依賴性。此外，中高劑量人參葛根植物飲料的攝入，能在一定程度上提高游泳后小鼠的能量物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，提高血糖水平，防止因大腦能量供應(yīng)不足而引起中樞疲勞，這是其組成原料人參、黃精等共同作用的結(jié)果[6-10]。但攝入高劑量人參葛根植物飲料的小鼠血糖水平無法持續(xù)升高，這可能是由于高劑量人參葛根植物飲料的攝入使小鼠的血糖含量恢復(fù)到正常水平后，并進(jìn)一步促進(jìn)了其轉(zhuǎn)化為糖原進(jìn)行儲備，其結(jié)果與肝糖原及肌糖原含量的變化趨勢相呼應(yīng)。結(jié)果表明人參葛根植物飲料的攝入使小鼠能量的儲備呈劑量依賴性的增加，并提高能量分解產(chǎn)物的濃度，提供持久的能量以支撐持續(xù)性運動，從而延緩因能量耗竭而引起的體力疲勞。

圖3 人參葛根植物飲料對運動小鼠的肌糖原、肝糖原、血糖水平的影響Fig.3 The effect of botanical beverage with ginseng extract and pueraria extract on muscle glycogen,liver glycogen and blood sugar levels in exercised mice

2.2.3 人參葛根植物飲料對小鼠運動后氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

乳酸脫氫酶和肌酸激酶的活性是判斷機(jī)體肌肉損傷程度的關(guān)鍵參數(shù)。乳酸脫氫酶作為無氧代謝的標(biāo)志性酶，在劇烈運動時，機(jī)體會發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞肌細(xì)胞的完整性，增大細(xì)胞膜通透性，進(jìn)而使血清中乳酸脫氫酶活性提升。同時，肌酸激酶作為一種重要激酶，能夠直接參與細(xì)胞內(nèi)能量的再生和運轉(zhuǎn)等過程，也是影響肌肉收縮的關(guān)鍵因素之一，此外，還是確定肌肉損傷程度的重要標(biāo)志物質(zhì)[24]。

由圖4可知，與游泳組相比，中劑量組的LDH活性以及中劑量組、高劑量組的CK活性均顯著降低，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，表明口服中劑量人參葛根植物飲料能緩解機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)、減輕急性運動對肌肉組織造成的損傷。這可能是因為人參葛根植物飲料各組分[18-20]能通過抑制細(xì)胞膜通透性、降低 LDH的活性，促進(jìn)乳糖的糖異生過程，進(jìn)而加快運動能力的恢復(fù)，同時，其還能達(dá)到降低運動后肌肉損傷的目的。

圖4 人參葛根植物飲料對運動小鼠的乳酸脫氫酶和肌酸激酶水平的影響Fig.4 The effect of botanical beverage with ginseng extract and pueraria extract on the levels of lactate dehydrogenase and creatine kinase in exercised mice

3 結(jié)論

通過建立負(fù)重游泳誘導(dǎo)的運動性疲勞模型，探討了人參葛根植物飲料對緩解體力疲勞作用的效果。結(jié)果表明，人參葛根植物飲料具有緩解體力疲勞的作用，且其作用效果呈一定的劑量依賴性，其中，中劑量人參葛根植物飲料對體力疲勞的改善效果最優(yōu)。灌胃中劑量、高劑量的人參葛根植物飲料使小鼠的疲勞轉(zhuǎn)棒時間和前肢拉力顯著增加，且中劑量人參葛根植物飲料能夠顯著提高體力疲勞小鼠的血糖水平和糖原儲備、減少血乳酸和尿素氮堆積、降低乳酸脫氫酶和肌酸激酶活性。綜上，人參葛根植物飲料能夠有效緩解負(fù)重游泳引起的小鼠體力疲勞。