醒腦解郁方對卒中后抑郁模型大鼠海馬神經元形態及凋亡的影響

王豆，李濤，馮亞倫，楊一帆，毛美玲，閆詠梅

1.陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是卒中后常見的神經精神并發癥，表現為除卒中以外的情緒低落、興趣下降、思維悲觀等抑郁癥狀，伴有相應軀體癥狀的綜合征。Meta分析表明，三分之一卒中幸存者出現PSD。PSD是功能恢復不良、生活質量不佳和康復結果不理想的主要因素。PSD涉及心理因素、遺傳易感性、單胺類遞質缺乏、神經營養因子不足、下丘腦-垂體-腎上腺軸失調、神經炎癥、突觸可塑性損傷、神經元凋亡等。陜西省名中醫閆詠梅教授團隊創制的醒腦解郁方臨床治療PSD療效顯著。本研究觀察醒腦解郁方對PSD模型大鼠海馬組織病理形態和凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達的影響，從海馬神經元凋亡方面探討醒腦解郁方防治PSD的作用機制，為其臨床應用提供依據。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠72只，成都達碩動物實驗公司提供，動物許可證號SCXK（川）2020-030，體質量（200±20）g，飼養于陜西中醫藥大學中心實驗室動物房，自由攝食飲水，適應性喂養1周。

1.2 藥物及制備

醒腦解郁方（石菖蒲12 g，遠志12 g，丹參30 g，柴胡12 g，合歡皮15 g，姜黃10 g，巴戟天10 g），飲片購自陜西中醫藥大學附屬醫院中藥房。所有飲片混勻，加10倍量蒸餾水常規煎煮2次，每次30 min，混合2次煎液，濃縮至原藥材濃度為1.05、2.1 g/mL，置于4℃冰箱保存備用。鹽酸氟西汀膠囊，20 mg/粒，禮來蘇州制藥有限公司，批號7723A，用蒸餾水配制成濃度為0.208 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

多聚甲醛固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號G1101），DAB顯色液（北京中杉金橋生物試劑公司，批號K182720A），中性樹膠（西安灝洋，批號LWG-15），HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號G1120），Nissl染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號G1432），RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、BCA蛋白定量檢測試劑盒、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠試劑盒、超敏ECL化學發光液（武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為14F27C02、14D28C78、14G02A83、14G30C40、14G22C12、14G29C38、14G10A97），PVDF膜（美國Epizyme，批號280679876），Bcl-2抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號BF9103），Bax抗體、β-actin抗體、抗兔二抗、抗鼠二抗（武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為BM3964、BM0627、MF094、MF093）。TC-120S型組織脫水機（上海寰熙醫療器械），TB-718E型組織包埋機（湖北泰維科技），RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司），DP73型光學顯微鏡（日本Olympus公司），JXFSTPRP-64型全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實業發展有限公司），Micro 17R型冷凍離心機（美國Thermo Fisher公司），PowerPac Basic凝膠電泳系統、GelDoc XR+型凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

采用大腦中動脈栓塞（MCAO）聯合慢性不可預知溫和刺激（CUMS）制備PSD大鼠模型。72只大鼠隨機分為假手術組、卒中組、PSD組、氟西汀組和醒腦解郁方低、高劑量組，每組12只。除假手術組外，其余各組采用線栓法制備MCAO模型，大鼠術前禁食禁水12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，沿頸部正中縱向切開皮膚及淺筋膜，鈍性分離后，充分暴露并分離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈及迷走神經，結扎近心端頸總動脈、頸外動脈，于頸內動脈近心端穿線備用，將栓線從頸總動脈分叉處插入頸內動脈，深度約18～22 mm，60 min后撤掉栓線，結扎頸內動脈近心端。假手術組僅暴露并分離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈及迷走神經，不插入栓線。術后連續3 d肌肉注射青霉素（4萬U/只）預防感染。術后24 h采用Longa 5分法對大鼠進行神經功能評定，取評分1～3分大鼠進行后續實驗。卒中造模成功后次日，除假手術組、卒中組外，其余各組采用改良CUMS法制備抑郁模型，包括禁食禁水、濕籠、夾尾、強迫游泳、電擊、晝夜顛倒、晃籠，每日給予大鼠1種刺激，7種刺激隨機進行，相鄰2 d刺激不同，連續21 d，造模期間每種刺激共使用3次；同時，氟西汀組予鹽酸氟西汀2.08 mg/kg灌胃；醒腦解郁方低、高劑量組分別予10.5、21 g/kg醒腦解郁方藥液灌胃（相當于60 kg成人劑量的1、2倍），假手術組、卒中組和PSD組予0.9%氯化鈉溶液灌胃，灌胃體積3 mL/只，連續21 d。

2.2 取材

末次給藥結束后，各組隨機取6只大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉，斷頭取全腦，冰盤上分離海馬組織，置于4%多聚甲醛中，4℃固定，用于HE染色和Nissl染色。剩余大鼠麻醉后用150 mL生理鹽水進行心臟灌注，迅速取腦，于冰盤上快速分離海馬組織，置于-80℃冰箱凍存，用于Western blot檢測。

2.3 一般狀況觀察

每日觀察并記錄大鼠精神狀態、自主活動、毛色、進食、飲水、糞便情況。

2.4 神經功能缺損評分

給藥結束后即刻，按照Longa 5分法對大鼠進行神經功能缺損評分。0分，無神經缺損；1分，肢體癱瘓側前爪舒展不完全；2分，行走時向肢體癱瘓側轉圈；3分，行走時向肢體偏癱側傾斜；4分，喪失自發行走能力，存在意識喪失現象。

2.5 海馬組織病理觀察

取4%多聚甲醛固定的海馬組織，經脫水、透明、常規石蠟包埋，切片，行HE、Nissl染色，顯微鏡下觀察海馬組織形態變化。

2.6 Western blot檢測

取100 mg海馬測組織，按1∶10加入裂解液（含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑），冰上裂解30 min，超聲勻漿，12000 r/min離心10 min，取上清液，采用BCA法檢測蛋白濃度。加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃煮5 min。按30 μg蛋白/孔道上樣，SDS-PAGE分離蛋白，轉移至PVDF膜，加5%脫脂牛奶，室溫封閉1 h。TBST洗膜，加入Bcl-2一抗（1∶1000）、Bax一抗（1∶1000）、β-actin一抗（1∶2000），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min，滴加二抗（1∶5000），室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。超敏ECL試劑曝光，凝膠成像系統觀察并拍照。利用Image J 2.0軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達量。

3 統計學方法

4 結果

4.1 醒腦解郁方對模型大鼠一般狀況的影響

卒中組大鼠精神萎靡，活動尚可，形體較瘦弱，毛色少光澤，毛量減少，飲食與糞便尚可；PSD組大鼠精神萎靡，活動性差，形體消瘦，毛色枯黃，毛量減少，飲食減少，糞便量較少、偶有稀溏；氟西汀組及醒腦解郁方低、高劑量組大鼠精神狀態尚可，活動量增加，毛色有光澤，毛量增多，飲食增多，糞便正常。

4.2 醒腦解郁方對模型大鼠神經功能缺損評分的影響

與假手術組比較，卒中組和PSD組大鼠神經功能缺損評分明顯升高（＜0.01）；與PSD組比較，氟西汀組及醒腦解郁方低、高劑量組大鼠神經功能缺損評分明顯降低（＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠神經功能缺損評分比較（±s，每組12只）

4.3 醒腦解郁方對模型大鼠海馬組織病理形態的影響

假手術組大鼠海馬組織神經細胞形態完整、排列密集，胞漿染色均勻，核仁清晰，細胞間隙無水腫，尼氏體豐富，未見明顯壞死、炎性細胞浸潤等病理改變；卒中組和PSD組大鼠海馬組織可見部分細胞結構模糊、排列紊亂、數量減少，胞核固縮，尼氏體數量減少，壞死灶邊緣有炎性細胞浸潤；氟西汀組及醒腦解郁方低、高劑量組大鼠海馬組織神經細胞結構較完整，細胞數量較多，排列較為緊密、整齊，尼氏體較豐富。見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠海馬組織形態（HE染色，×400）

圖3 各組大鼠海馬組織形態（Nissl染色，×400）

4.4 醒腦解郁方對模型大鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值的影響

與假手術組比較，卒中組和PSD組大鼠海馬組織Bax蛋白表達明顯升高（＜0.01），Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值明顯降低（＜0.01）；與PSD組比較，氟西汀組及醒腦解郁方低、高劑量組大鼠海馬組織Bax蛋白表達明顯降低（＜0.01），Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值明顯升高（＜0.01）。見圖4、表1。

圖4 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白免疫印跡

表1 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值比較（±s）

5 討論

根據PSD癥狀，可歸屬于中醫學“中風”“郁證”范疇。依據發病次序，為“中風后郁證”，但多從“郁證”論治。西醫學認為PSD是抑郁的一種特殊類型。《CCMD-3中國精神障礙分類與診斷標準（第二版）》將其歸入“腦血管病所致精神障礙”。此外，PSD的臨床表現具有復雜性、多樣性，除具備卒中本身的神經功能損傷癥狀外，還有核心和非核心癥狀之分。其中核心癥狀為抑郁、興趣減退、易疲勞，嚴重者有自殺傾向。非核心癥狀以體質量下降、睡眠障礙、不明原因疼痛、食欲減退或亢進、性欲減退等生理癥狀為主，可伴有注意力下降、緊張不安、焦慮、運動性激越、自責、自罪等。

PSD發生的機制和學說主要包括遺傳機制、社會心理學說、生物學機制等。PSD的遺傳機制與個人、家族史、基因等有關。社會心理學說即生物-心理-社會模式，卒中后患者日常生活質量下降，疾病負擔沉重，家庭及社會環境改變，致患者心理應激障礙，心理平衡失調，導致PSD發生。PSD作為一種器質性情感障礙，其神經生物學基礎主要是5-羥色胺、去甲腎上腺素及多巴胺等單胺類遞質失衡，神經營養因子不足，下丘腦-垂體-腎上腺軸功能異常，機體腸道菌群紊亂，中樞神經系統炎癥因子水平升高，海馬、杏仁核、額葉皮質等部位神經突觸可塑性損傷，細胞自噬與凋亡等。其中神經細胞凋亡在PSD的發病過程中存在持續作用，被認為與PSD等并發癥的發生發展關系密切。

細胞凋亡是一種程序性的細胞死亡，生理情況下有益于機體代謝，病理狀態下則造成組織損傷。卒中后缺血、缺氧導致腦內自由基、谷氨酸、炎癥因子等異常增多，產生細胞毒性作用，進而損傷神經元及突觸可塑性，誘導神經細胞凋亡，影響卒中恢復或導致抑郁等合并癥。線粒體凋亡途徑是細胞凋亡的關鍵環節，Bcl-2蛋白是重要的抗凋亡蛋白，Bax是主要的促凋亡蛋白。Bcl-2/Bax比值可直接反映細胞凋亡狀態，Bcl-2/Bax比值降低提示促進凋亡，升高則細胞凋亡被抑制。已有研究顯示，抑制凋亡可明顯改善神經功能，改善抑郁癥狀。臨床研究顯示，PSD患者血清Bax、Caspase-3等凋亡因子表達顯著升高，藥物逆轉凋亡蛋白表達后，抑郁癥狀明顯改善。動物實驗發現，PSD模型大鼠海馬組織Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達下降。部分抗抑郁藥物可調節海馬組織Bax、Bcl-2蛋白表達，改善PSD大鼠抑郁狀態，可能與促進腦源性神經營養因子（BDNF）表達有關。課題組前期動物實驗發現，醒腦解郁方可通過BDNF/ERK/CREB通路和降低促炎因子表達改善PSD模型大鼠抑郁狀態，發揮明顯抗抑郁作用。因此，本研究進一步探討醒腦解郁方對PSD模型大鼠海馬組織凋亡相關蛋白表達的影響。結果表明，醒腦解郁方可通過上調海馬組織抗凋亡蛋白Bcl-2表達，下調促凋亡蛋白Bax表達，升高Bcl-2/Bax比值，發揮抗PSD作用。

PSD與海馬區神經元萎縮密切相關。影像學研究發現，重度抑郁患者大腦海馬體積有不同程度縮小，突觸數量亦有所減少。動物模型可見海馬超微結構改變，包括海馬樹突萎縮、神經元增殖減少。慢性應激誘導的抑郁動物模型還可觀察到海馬區神經元、膠質細胞均出現萎縮和缺失現象，且上述改變在應用抗抑郁藥物后可逆轉。相較于單純中風患者，PSD患者日常生活質量明顯下降，尤其在認知、情感、肢體功能及社會功能等領域。中風后神經元損傷或凋亡是PSD不良預后的重要原因。減輕神經元損傷，保護神經元存活，促進神經元修復和再生可能是預防和治療PSD的重要手段。當神經元受損時，尼氏體發生溶解和消失。本實驗發現，PSD模型大鼠海馬神經元數量減少、排列紊亂，胞核皺縮、溶解、碎裂，胞漿濃縮，細胞間隙變大，尼氏體數量減少；醒腦解郁方治療后，大鼠海馬組織神經細胞結構較完整，細胞數量較多，形態呈圓形或橢圓形，排列較為緊密、整齊，尼氏體較豐富，表明醒腦解郁方可減輕和修復神經元損傷。

PSD臨床治療以抗抑郁藥物為主，雖具有不同程度療效，然而存在肝腎毒性、撤藥綜合征，增加心腦血管疾病風險等，限制臨床應用。閆詠梅教授將PSD的核心病機概括為痰瘀交阻、氣郁不暢、正氣虧虛，創制醒腦解郁方，臨床應用數十年，療效顯著。醒腦解郁方由石菖蒲、遠志、丹參、柴胡、合歡皮、姜黃和巴戟天組成。藥理研究表明，石菖蒲超臨界萃取物可改善大鼠抑郁樣行為，其主要成分β-細辛醚可通過調節神經元存活發揮抗抑郁作用；遠志活性部位YZ-50可抑制神經細胞損傷和凋亡，發揮抗抑郁作用；丹參酮可保護腦缺血引起的神經元損傷及凋亡；柴胡皂苷A可通過促進海馬區BDNF表達，減少神經細胞凋亡，發揮抗抑郁作用。

綜上，醒腦解郁方可通過改善海馬神經元形態，促進海馬組織抗凋亡蛋白Bcl-2表達，抑制促凋亡蛋白Bax表達，增加Bcl-2/Bax比值，發揮抗PSD作用。