基于“腸-腦互動”探討溫腎健脾方對脾腎陽虛型腹瀉型腸易激綜合征大鼠內臟敏感性及c-Fos表達的影響

蔣天媛，牛然，劉倩，羅曉穎，張濤，楊洋，蘇曉蘭，吳寶麒，韓娟，魏瑋

1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.功能性胃腸病中醫診治北京市重點實驗室，北京 100102；3.中國中醫科學院望京醫院，北京 100102；4.中國中醫科學院針灸研究所，北京 100700

腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）是臨床常見功能性腸病，以腹痛、排便次數增多、大便不成形為主要臨床表現，同時缺乏器質性改變。內臟高敏感性被認為是其核心病理機制，包括外周敏化和中樞敏化，內臟高敏在一定程度上是“腸-腦互動”神經信號傳遞異常的表現之一。背根神經節作為外周神經系統與中樞神經系統信號傳遞的中轉站，在“腸-腦互動”中具有重要作用。海馬是與認知相關的重要結構，母嬰分離作為早期生活不良事件，對海馬中成體神經發生具有抑制效應，并可使海馬可塑性降低。機體對傷害性刺激信號的放大可能是敏化的關鍵環節，c-Fos被認為是細胞內信號級聯反應的關鍵效應因子，應激時可以放大傷害性刺激信號，與內臟高敏感性密切相關，可能成為治療IBS-D的重要靶點。

IBS-D目前尚無特異性治療方案，給患者生命健康和生活質量帶來嚴重影響。傳統對癥治療主要關注腸道局部癥狀，難以實現對腸道及中樞的多維調控。課題組前期基于文獻研究認為脾腎陽虛是IBS-D反復發作、遷延不愈的重要原因，并基于臨床實踐歸納提出溫腎健脾法，擬溫腎健脾方應用于臨床，療效顯著。基于此，本實驗觀察溫腎健脾方對脾腎陽虛型IBS-D大鼠糞便性狀、內臟敏感性、腸道吸收功能及c-Fos在結腸組織、背根神經節和海馬組織表達的影響，基于“結腸-背根神經節-海馬”3個環節探討溫腎健脾方改善IBS-D模型大鼠內臟敏感性，緩解IBS-D癥狀的可能作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

1日齡SPF級雄性SD大鼠32只、12周齡SPF級SD母鼠5只，中國中醫醫科學院動物實驗中心提供，動物許可證號SCKK（京）2012-0004。飼養于中國中醫科學院針灸研究所，溫度（23±2）℃，相對濕度（60±5）%，12 h晝夜交替。予標準飼料及飲用水喂養。本實驗經中國中醫科學院針灸研究所實驗動物倫理委員會批準（D2021-03-16-3）。

1.2 藥物及制備

溫腎健脾方（肉豆蔻15 g，補骨脂30 g，五味子9 g，吳茱萸6 g，太子參30 g，白術10 g，郁金18 g，生姜10 g，大棗10 g），復方顆粒購自中國中醫科學院望京醫院顆粒藥房，1劑顆粒相當于原藥材12.2 g，使用時加蒸餾水配制成0.11 g/mL溶液。番瀉葉顆粒，中國中醫科學院望京醫院中藥配方顆粒藥房提供（購自四川新綠色藥業科技發展有限公司），取50 g番瀉葉顆粒，加入50 mL 100℃飲用水完全溶解，配制成濃度為1 g/mL番瀉葉水溶液。匹維溴銨片，法國Mylan Laboratories SAS公司，批號0160396，50 mg/片，將匹維溴銨片研碎后與適量蒸餾水混合，配制成濃度為2.7 mg/mL混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

D-木糖測定試劑盒，南京建成生物工程研究所，貨號A035-1-1；蘇木素染液，武漢云克隆科技股份有限公司，貨號C1001；TRNzol Universal Reagent試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司，貨號DP424；EasyScrpt One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，北京全式金生物技術有限公司，貨號AE311-03；HieffqPCR SYBR Green Master Mix試劑盒，上海翊圣生物，貨號11201ES08；c-Fos抗體，英國Abcam，貨號ab208942；組織裂解液，武漢云克隆科技股份有限公司，貨號A101；BCA總蛋白定量測定試劑盒（微孔板法），武漢云克隆科技股份有限公司，貨號A202。Bead Ruptor 12多樣品研磨珠均質儀，美國Omni；D3024R臺式高速冷凍型微量離心機，北京DragonLab；LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀，瑞士Roche；NanoDrop2000超微量分光光度計，美國Thermo；ELx808酶標儀，美國BioTek；5600F掃描儀，佳能（中國）有限公司；CK31正置光學顯微鏡，日本奧林巴斯；TVO.63XC-MO成像系統，廣州明美。

2 實驗方法

2.1 分組與造模

32只大鼠采用隨機數字表法分為正常組、模型組、匹維溴銨組和溫腎健脾方組，每組8只。除正常組外，其余各組采用母子分離聯合番瀉葉灌胃建立脾腎陽虛型IBS-D大鼠模型：每日上午9:00－12:00將子鼠與母鼠分籠3 h，連續3周；適應性喂養1周；第5周開始予番瀉葉水溶液1 g/mL灌胃，灌胃體積10 mL/kg，每日1次，連續6周。

2.2 干預

造模結束后，根據人與大鼠體表面積換算給藥劑量，匹維溴銨組予匹維溴銨混懸液13.50 mg/kg灌胃，溫腎健脾方組予溫腎健脾方溶液1.1 g/kg灌胃，正常組和模型組予生理鹽水灌胃，灌胃體積10 mL/kg，每日1次，連續14 d。

2.3 檢測指標

2.3.1 糞便性狀評分

干預結束后將大鼠單籠飼養，于飼養籠內放置濾紙以觀察大鼠糞便性狀，并根據Bristol糞便性狀量表進行評分：1分，分散的硬塊，似堅果；2分，臘腸狀，但成塊；3分，臘腸狀，表面有裂縫；4分，似臘腸或蛇，光滑柔軟；5分，軟團，邊緣清楚；6分，絨狀物、邊緣不清，糊狀便；7分，水樣，無固狀物。

2.3.2 內臟敏感性檢測

干預結束后，參照腹壁撤退反射（AWR）實驗方法自制結直腸測壓計，測定大鼠內臟敏感性。實驗前大鼠禁食不禁水18 h，確認其排盡大便后，將球囊涂抹石蠟油并塞入大鼠肛門約7 cm，在肛門外1 cm處用醫用膠帶將其固定于大鼠尾根部，將大鼠置于18 cm×8 cm×6 cm特制小籠中，使其不得轉頭，待其完全平靜后緩慢向球囊內充氣，觀察大鼠腹壁對腸腔球囊擴張刺激的反應。分別使用20、40、60、80 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）4個壓力，每次擴張持續20 s。AWR評分標準：0分，給予結直腸擴張刺激時大鼠情緒基本穩定；1分，給予刺激時情緒不穩定，偶爾扭動頭部；2分，腹背部肌肉輕微收縮但腹部未抬離地面；3分，腹背部肌肉較強烈收縮且腹部抬離地面；4分，腹部肌肉強烈收縮，腹部呈弓形且腹部、會陰部抬離地面。

2.3.3 腸道吸收功能檢測

大鼠先予5%D-木糖溶液0.3 g/kg灌胃，1 h后腹腔注射5%異戊巴比妥（4 mL/kg）麻醉，仰臥固定于平板上，腹主動脈取血5～8 mL，室溫靜置20 min，3000 r/min離心15 min，收集上清液，采用生化法檢測血清D-木糖含量。

2.3.4 HE染色

取距肛門5～8 cm處結腸組織，生理鹽水沖洗干凈，置于10%中性福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，切片（厚度2 μm），常規HE染色，用CaseViewer 2.1軟件觀察結腸組織病理變化。

2.3.5 qRT-PCR檢測

取距肛門3～5 cm處結腸組織；參照文獻[14-15]分離背根神經節；斷頭取腦，距離大腦皮質后緣約5 mm位置沿中弧線用刀片切開，將切開的皮質鈍性分離后取海馬。分別將結腸組織、背根神經節、海馬組織置于2 mL凍存管中，放入液氮中暫存，后轉至-80℃冰箱保存。

采用Trizol法提取總RNA，按照42℃、15 min，85℃、5 s反應程序將RNA反轉錄為cDNA。加入相應引物和熒光染料擴增，反應條件：95℃、5 min，95℃、5 s，55℃、30 s，72℃、20 s，共44個循環。采用2法計算mRNA相對表達量，引物由通用生物系統（安徽）有限公司設計合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.3.6 Western blot檢測

將組織剪成小塊，按1∶20加入預冷的裂解液，充分裂解后，4℃、10000 r/min離心5 min，取上清液，BCA法測定蛋白含量；將蛋白樣品與上樣緩沖液按4∶1混合，蛋白變性后上樣，進行凝膠電泳，將蛋白轉至PVDF膜，以5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，PBST搖床震蕩洗滌3 min×2次；加入c-Fos一抗（1∶1000），37℃搖床孵育120 min，PBST搖床震蕩洗滌3 min×2次；加入二抗，37℃孵育60 min，PBST搖床震蕩洗滌3 min×2次；ECL試劑盒顯影，凝膠成像系統進行分析。以GAPDH為內參，Image J1.8.0軟件分析條帶灰度值，以目的條帶與內參條帶灰度值比值計算蛋白相對表達量。

3 統計學方法

4 結果

4.1 溫腎健脾方對模型大鼠Bristol糞便性狀評分的影響

與正常組比較，模型組大鼠Bristol糞便性狀評分顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，溫腎健脾方組大鼠Bristol糞便性狀評分顯著減少（＜0.01）；與匹維溴銨組比較，溫腎健脾方組大鼠Bristol糞便性狀評分顯著減少（＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠Bristol糞便性狀評分比較（±s，每組8只）

4.2 溫腎健脾方對模型大鼠腹壁撤退反射評分的影響

與正常組比較，模型組大鼠20、40、60、80 mm Hg壓力水平下AWR評分均顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，溫腎健脾方組大鼠20、40、60、80 mm Hg壓力水平下AWR評分均顯著減少（＜0.01）；與匹維溴銨組比較，溫腎健脾方組大鼠40 mm Hg壓力水平下AWR評分顯著減少（＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠不同壓力水平下AWR評分比較（±s，分）

4.3 溫腎健脾方對模型大鼠血清D-木糖含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清D-木糖含量顯著減少，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，匹維溴銨組和溫腎健脾方組大鼠血清D-木糖含量顯著增加，差異有統計學意義（＜0.01）；與匹維溴銨組比較，溫腎健脾方組大鼠血清D-木糖含量顯著增加，差異有統計學意義（＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠血清D-木糖含量比較（±s，每組8只）

4.4 溫腎健脾方對模型大鼠結腸組織病理形態的影響

正常組大鼠結腸黏膜完整，上皮細胞排列整齊，形態一致，未見糜爛、潰瘍病變；模型組大鼠結腸黏膜可見輕度水腫，上皮細胞排列紊亂；匹維溴銨組和溫腎健脾方組大鼠結腸組織病變有不同程度改善。見圖3。

圖3 各組大鼠結腸組織形態（HE染色，×80）

4.5 溫腎健脾方對模型大鼠結腸組織、背根神經節、海馬組織c-Fos mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠結腸組織、背根神經節、海馬組織c-Fos mRNA表達顯著升高，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，匹維溴銨組和溫腎健脾方組大鼠結腸組織、背根神經節、海馬組織c-Fos mRNA表達顯著降低，差異有統計學意義（＜0.01）；與匹維溴銨組比較，溫腎健脾方組大鼠結腸組織c-Fos mRNA表達顯著降低（＜0.01），海馬組織c-Fos mRNA表達顯著升高（＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠不同組織c-Fos mRNA表達比較（±s）

4.6 溫腎健脾方對模型大鼠結腸組織、背根神經節、海馬組織c-Fos蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠結腸組織、背根神經節、海馬組織c-Fos蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，匹維溴銨組和溫腎健脾方組大鼠結腸組織、背根神經節、海馬組織c-Fos蛋白表達顯著降低（＜0.01，＜0.05）；與匹維溴銨組比較，溫腎健脾方組大鼠結腸組織c-Fos蛋白表達顯著降低（＜0.01），背根神經節c-Fos蛋白表達顯著升高（＜0.05）。見表4、圖4。

表4 各組大鼠結腸組織、背根神經節、海馬組織c-Fos蛋白表達比較（±s）

圖4 各組大鼠不同組織中c-Fos蛋白免疫印跡

5 討論

腦-腸軸是“腸-腦互動”的神經解剖學基礎，中樞神經系統和腸神經系統間存在雙向聯系，從而影響感覺、運動、內分泌、自主神經、免疫功能。一方面，當情緒變化，如焦慮、恐懼，或生理應激時，可以刺激結腸運動功能，表現為結腸收縮加強、誘發排便，甚至出現腹瀉癥狀，同時可以改變內臟敏感性/腸道疼痛閾值，削弱黏膜屏障功能；另一方面，內臟器官炎癥和損傷可放大上行內傳通路信號，影響腦區活動，引起更明顯的疼痛。

IBS-D是較為典型的“腸-腦互動”異常疾病，內臟高敏可能是“腸-腦互動”異常導致的表現之一。機體疼痛閾值降低和/或機體對疼痛信號的放大是形成內臟高敏狀態的重要環節。內臟感覺信號經內臟感覺傳入神經傳遞至位于脊髓背根神經節的神經元胞體后交叉至對側，上行傳輸至大腦皮層產生內臟感覺。背根神經節所含的初級感覺神經元可以將傷害性刺激轉化為動作電位，從外周傳遞至中樞神經系統，產生傷害性或疼痛信號。反復應激可強化海馬區傷害性刺激相關的神經連接。c-Fos屬于早期即刻基因，可被第二信使誘導，能對神經遞質、激素、神經沖動等外界刺激引起的傳入信息在短時間內作出反應，可作為傷害性神經元激活的標志，是影響突觸功能的重要因子。多項研究顯示，應激刺激后，大鼠脊髓、延髓孤束核和腦組織c-Fos表達明顯增加。據此，基于“腸-腦互動”異常，考慮反復慢性應激可以通過調節突觸可塑性影響感覺信號傳導，進而改變結腸功能及內臟敏感性。

本研究結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠Bristol糞便性狀評分顯著增加，血清D-木糖含量顯著減少，各壓力水平下AWR評分均顯著升高，表明模型組大鼠糞便性狀、腸道吸收功能及內臟敏感性均有明顯改變。與模型組比較，溫腎健脾方組大鼠Bristol糞便性狀評分顯著降低，血清D-木糖含量顯著增加，AWR評分在各壓力水平下均顯著降低，表明溫腎健脾方可以改善IBS-D模型大鼠糞便性狀、腸道吸收功能及內臟敏感性。PCR和Western blot結果顯示，模型組大鼠結腸組織、背根神經節、海馬組織c-Fos mRNA及蛋白表達顯著升高，提示IBS-D模型大鼠結腸組織、背根神經節、海馬組織c-Fos表達具有一致性，與相關文獻結果一致；溫腎健脾方組大鼠結腸組織、背根神經節、海馬組織c-Fos mRNA及蛋白表達顯著降低，表明溫腎健脾方可以下調IBS-D模型大鼠結腸組織、背根神經節、海馬組織c-Fos表達。課題組前期研究顯示，溫腎健脾方可能通過調節IBS-D模型大鼠背根神經節N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體及其磷酸化蛋白表達，調節內臟敏感性。同時相關研究表明，NMDA受體對c-Fos表達有促進作用。因此，本研究表明溫腎健脾方通過調節結腸組織、背根神經節、海馬組織c-Fos表達，緩解內臟高敏狀態，改善腸道吸收功能及糞便性狀。

中醫認為，腎為先天之本，脾為后天之本，疾病發作日久往往累積于腎，因此，脾腎陽虛是IBS-D發作的關鍵病機，治以溫腎健脾為主，選用《證治準繩》所載四神丸加減化裁。方中補骨脂補腎助陽、溫脾止瀉，尤善補命門之火以散寒邪；肉豆蔻溫補脾腎、澀腸止瀉，為治療虛寒性瀉痢之要藥；吳茱萸溫暖脾胃以散其陰寒之邪；五味子溫腎固澀，與吳茱萸相配共奏溫澀止瀉之功。在此基礎上，以太子參、白術健脾益氣，郁金清心解郁；姜棗同煮，溫補脾胃，鼓舞中焦運化。全方溫補并用，通調兼施。現代藥理研究表明，太子參多糖可以作用于腦神經元，實現對神經活動的調控作用；白術提取物具有保護神經活性作用，能通過調節γ-氨基丁酸受體發揮抗焦慮作用；郁金提取物可通過降低神經病理性疼痛模型大鼠血清腦源性神經營養因子水平減輕神經病理性疼痛。

綜上，本研究表明溫腎健脾方能下調IBS-D模型大鼠結腸組織、背根神經節、海馬組織c-Fos表達，可能是該方調節內臟高敏性的重要靶點，為該方“腦腸同調”的臨床應用提供一定依據。