慢性萎縮性胃炎與淺表性胃炎患者舌象特點及其微生物群落結構分析

王亞楠，袁莉，汪莉，徐志遠，阮華，程向東，董昌武

1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230000；2.中國科學院大學附屬腫瘤醫院，浙江 杭州 310022；3.杭州市余杭區中醫院，浙江 杭州 310022

慢性胃炎（chronic gastritis，CG）是由多種因素引起的黏膜炎癥性疾病，臨床表現以上腹部疼痛、胃脘部脹滿、反酸嘈雜為主，且易反復發作，嚴重影響患者的生活質量。CG屬中醫學“胃脘痛”“痞滿”“泛酸”等范疇。胃炎的發展是一個多步驟、多因素的過程，可分為淺表性胃炎、萎縮性胃炎、腸化生和異型增生。研究表明，胃炎的發展會增加患胃癌的風險。目前，臨床主要通過胃鏡和病理組織學檢查進行胃炎診斷，中醫通過望舌可以了解機體內在氣血盛衰與陰陽虛實，《臨癥驗舌法》所謂“凡內外雜癥，無一不呈其形，著其色于舌”，故在胃炎防治中可通過觀察舌象進行疾病的監測和控制。

舌苔微生物是口腔菌群的重要組成部分，舌苔菌群的變化可以為疾病的診斷和治療提供幫助。本研究采用橫斷面研究方法，通過中醫舌診AI開放平臺系統對167例CG患者的舌象進行分析，同時采用高通量測序技術對樣本中的16S rDNA基因進行測序分析，以研究舌苔微生物群。

1 資料與方法

1.1 病例來源

選取2021年1－9月杭州市余杭區中醫院消化內科經電子內鏡和病理組織學檢查確診的慢性萎縮性胃炎（CAG）患者86例、慢性淺表性胃炎（CSG）患者81例，同時收集其舌象圖片、舌苔樣本及病歷資料。本研究經中國科學院大學附屬腫瘤醫院醫學倫理委員會批準（IRB-2019-56）。

1.2 診斷標準

參照《中國慢性胃炎共識意見（2017年，上海）》，CG的內鏡診斷系指肉眼或特殊成像方法所見的黏膜炎性變化，需與病理學檢查結果結合做出最終判斷。CSG患者內鏡結果顯示斑點和條狀紅斑，黏膜粗糙不均勻，出血點，糜爛和膽汁反流。CAG患者內鏡結果顯示胃黏膜以白色為主，褶皺變平，黏膜血管暴露，存在黏膜結節，同時，病理活檢顯示固有腺體萎縮。

1.3 納入標準

①年齡40～80歲，性別不限；②無明顯口腔疾病；③3個月內未使用過影響舌面顏色的藥物；④新診斷且未經治療；⑤有完整的舌面圖像（入組時舌象收集完成）；⑥患者均對本研究知情，并簽署知情同意書。

1.4 排除標準

①無法耐受胃鏡檢查；②合并胃癌、胃出血等腸道疾病；③合并嚴重臟器疾病及精神類疾病，語言障礙不能溝通；④哺乳期、孕期婦女；⑤不會伸舌或伸舌困難者；⑥DNA提取量不足，無法進行測序工作。

1.5 舌象采集與分析

1.5.1 采集時間與方法

于清晨患者未進食狀態下采集舌象。拍攝時囑患者放松自然地伸出舌頭，保持舌面展平、舌體放松、舌尖朝下的狀態。

1.5.2 設備和軟件

采用配備高清攝像頭的移動智能手機，支持自然光源拍攝。采用安徽中醫藥大學與合肥云診信息科技有限公司聯合研發的中醫舌診AI開放平臺系統，通過捕捉舌象，自動提取特征，以輔助中醫診斷。系統的價值取決于其校準亮度和顏色的能力，以補償來自光源和成像硬件的強度和色溫的變化。舌體區域圖像被自動分割以獲得相關的舌體特征。系統提取中醫舌診的主要特征，進一步生成有關長度、面積、濕度和舌部特征數量的詳細信息。結合人工判斷，形成最終分類，提取5類舌象。①舌色：淡紅舌、紅舌、絳舌；②苔色：白色、黃色；③苔的厚薄：厚、薄、剝落；④苔的腐膩：腐、膩、正常；⑤舌質潤燥：即唾液面積占舌體總面積的比例（燥或潤）。

1.6 舌苔菌群分布

1.6.1 主要試劑與儀器

Pusion Hot start flex 2X Master Mix，上海儀濤生物儀器有限公司（M0536L）；DL2000 DNA Maker，Takara（3427A）；Stool DNA Kit（200），OMEGA bio-tek（D4015-02）；AMPure XT beads，Beckman（A63880）；Gene colour，北京 金博益（GBY-1）；Qubit dsDNA HS Assay Kit（500次），Invitrogen，Life technologies（Q32854）；生工50×TAE Buffer，上海 生 工（B548101-500）；Biowest Agarose G-10，BIOWEST（111860）。

常溫離心機（Eppendorf Centrifuge 5424），旋渦震蕩儀（華利達，WH-861 Vortex Shaker），三溫三控恒溫水浴鍋（上海博迅實業有限公司，DK-8D），PCR儀（杭州朗基科學儀器有限公司，A200基因擴增儀），電泳儀（Tanon天能，EPS300），凝膠成像儀（Tanon-2500），超低溫冷凍儲存箱（中科美菱低溫科技有限責任公司，DW-HL388）。

1.6.2 樣本采集

隨機收集CAG、CSG各30例舌苔樣本，取樣前漱口，使用一次性無菌拭子刮取患者舌面3～5次，將其置于1.5 mL舌苔樣本收集小管（含保存液）中，12000 r/min離心5 min，去除上清液，置于超低溫冷凍儲存箱中備用。

1.6.3 DNA抽取與PCR擴增

對樣本舌苔進行微生物組總DNA提取，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，同時采用紫外分光光度計對DNA進行定量。利用細菌16S rDNA基因V3～V4可變區進行PCR擴增，引物序列：341F（5"-CCTACGGGNGGCWGCAG-3"）805R（5"-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3"），PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳確證，PCR產物由AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，USA）純化，Qubit（Invitrogen，USA）定量。擴增子池用于測序，擴增子文庫的大小和數量分別在Agilent2100生物分析儀（Agilent，美國）和Illumina（Kapa Biosciences，Woburn，MA，美國）的文庫定量試劑盒上進行評估，樣品在Illumina NovaSeq平臺上進行測序。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 2組一般資料比較

CAG組、CSG組性別、吸煙、飲酒比較差異無統計學意義（＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 CAG組和CSG組一般資料比較

2.2 2組舌象比較

舌色方面，CAG患者以紅舌為主，CSG患者以淡紅舌為主；苔色方面，CAG患者以黃苔為主，CSG患者白苔為主；苔的厚薄方面，CAG患者厚苔居多，CSG患者薄苔較多；苔的腐膩方面，CAG患者以膩苔為主，CSG患者以正常為主；舌質潤燥方面，2組均以潤為主，CAG較CSG患者燥舌增加。2組舌色、苔色、苔的厚薄及腐膩、舌質潤燥差異有統計學意義（＜0.01）。見表2。

表2 CAG組和CSG組舌象比較［例（%）］

2.3 2組舌苔高通量測序數據比較

對原始下機數據進行雙端拼接、質量控制、嵌合體過濾后，進行高質量數據統計，見表3。2組在有效片段數（=0.124）、片段長度（=0.525）、Q20%（=0.220）、Q30%（=0.160）、GC%（=0.695）等方面比較差異無統計學意義。

表3 舌苔高通量測序2組比較（xˉ±s，n=30）

2.4 2組舌苔菌群Alpha多樣性比較

Alpha多樣性是指一個特定環境或生態系統內的多樣性，主要反映物種豐富度和均勻度及測序深度。Alpha多 樣 性 主 要 通 過Chao1、Observed species、Goods_coverage、Shannon、Simpson等指數反映豐富度和均勻性。Chao1、Observed_species指數主要反映樣本的物種豐富度信息；Goods_coverage反映樣本的低豐度feature覆蓋情況；Simpson/Shannon主要綜合體現物種的豐富度（Richness）和均勻度（Eveness）。由圖1可知，CAG與CSG舌苔微生物Alpha多樣性指數差異有統計學意義（＜0.05），說明2組舌苔微生物群落差異顯著，CAG組的菌群多樣性明顯高于CSG組。

圖1 CAG組和CSG組舌苔菌群多樣性比較

2.5 2組舌苔菌群組成比較

Venn分析可知，2組共有菌群1213種，其中CAG組特有菌群1880種，CSG組特有菌群1264種。根據物種豐度表和物種注釋表，選取豐度最高的30個物種分類，將每個分組的相對豐度以堆疊柱狀圖形式展現，從而比較樣品豐度。結果顯示，在門水平，菌群分布以擬桿菌門、變形桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門為主，其中CAG組梭桿菌門的分布高于CSG組，擬桿菌門、變形桿菌門的分布低于CSG組，見圖2a；在屬水平，菌群分布以奈瑟菌屬、普雷沃氏菌屬_7、嗜血桿菌屬、卟啉單胞菌屬為主，其中CAG組奈瑟菌屬分布低于CSG組，卟啉單胞菌屬分布高于CSG組，見圖2b。

圖2 CAG組與CSG組舌苔菌群平均相對豐度

2.6 2組舌苔菌群顯著性差異分析

根據樣品物種豐度表，采用Mann-Whitney檢驗（適用于有生物學重復2組樣品差異比較）進行物種差異檢驗。在門水平影響分組的2種菌是梭桿菌門、Candidatus_Saccharibacteria（見圖3a），在屬水平影響分組的18種菌是鏈桿菌屬、普雷沃氏菌屬ceae_UCG-001、Ruminococcus_gnavus_group、、等（見圖3b）。

圖3 CAG組與CSG組舌苔菌群顯著性差異分析

2.7 2組舌苔菌群LEfSe差異分析

LEfSe（LDA effect size）分析主要目的是比較不同組間在豐度上有顯著差異的物種，能夠更加直觀展現組間所有層級的差異物種。圖4顯示，2組門水平的梭桿菌門、屬水平的有顯著差異，且在CAG組中的豐度更高。

圖4 CAG組與CSG組舌苔菌群LEfSe差異分析

2.8 舌苔菌群相關性網絡

相關性網絡圖（SparCC）是通過計算屬水平豐度top30的微生物豐度，獲得兩兩優勢菌群間的相關性及顯著性（值），再用相關性繪制網絡圖。由圖5可見，普雷沃氏菌屬_7與普雷沃氏菌屬、韋榮氏球菌屬呈正相關，與卟啉單胞菌屬、嗜血桿菌屬呈負相關，嗜血桿菌屬與卟啉單胞菌屬、奈瑟菌屬呈正相關。與其他菌的數目關聯最多的細菌是普雷沃氏菌屬_7、嗜血桿菌屬。

圖5 CAG組與CSG組屬水平豐度top30的舌苔菌群相關性網絡

3 討論

舌象可反映機體內在氣血盛衰與陰陽虛實，近年來舌診研究在客觀化、標準化方面取得一定進步。目前大多數學者認同正常胃黏膜-CSG-CAG-癌前病變-胃癌的發展模式，認為CSG病情程度較CAG輕。中醫學認為，正常人多表現為淡紅舌、薄白苔，病情越發展舌象變化越明顯。本研究中，我們發現CAG患者舌象以紅舌、黃苔、厚苔、膩苔為主，CSG患者以淡紅舌、白苔、薄苔為主。《傷寒舌鑒》有“夫紅舌者，伏熱內蓄于心胃，自里而達于表也”。CAG患者舌色以紅為主，認為內有熱象。西醫學認為舌色發紅多見于感染發熱患者或慢性消耗性患者。《辨舌指南》有“黃苔主里……全舌黃苔者，臟腑俱熱”。研究發現，苔色受細胞生長分化和溶解退化間動態平衡影響。研究發現，舌苔隨細胞代謝速率改變產生敏感變化，體現在舌苔厚薄與細胞生長分化和溶解退化的動態改變。《溫熱經緯》有“舌苔厚而有根，濁邪瘀結”。以上均表明中醫舌診可為疾病提供潛在的篩查和早期診斷方法，欲獲得更科學的結論仍需調查更大樣本量及更精確的生物組學證據。

解剖學認為，舌與消化系統密切相關。脫落上皮、唾液、食物碎屑、透出的白細胞等共同組成舌苔，飲食習慣、生活方式和微生態環境等多種因素影響舌苔變化。1984年，Marshall等發現胃幽門螺桿菌在CG中發揮重要作用，表明細菌是導致胃炎的因素。但既往研究發現，約25%的CG患者沒有感染幽門螺桿菌，表明其他能夠引起炎癥的細菌參與了該過程。此后，眾多研究者證實了除幽門螺桿菌以外的細菌在胃病中的作用。現代研究表明，16S rDNA基因的高通量測序在鑒定口腔微生物群中的綜合細菌方面發揮著至關重要的作用，目前已有研究者利用該技術調查了口腔細菌群落與胃炎發展的潛在關系。本研究對CAG組和CSG組舌苔微生物菌群進行檢測和分析，以探討特定圖像產生的深層原因，發現2組樣本中盡管存在大量相同物種，但其微生物組成、多樣性和功能存在一定差異。

本研究與既往研究結果一致，認為擬桿菌門、變形桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門是鑒定出的4個最具優勢的門。在屬水平上，奈瑟菌屬、普雷沃氏菌屬_7是最豐富的屬。充分說明這些菌群在CG人群的舌苔微生物中占據重要地位，是構成口腔中舌苔微生物群落結構的最基礎成分。此外，門水平上，CAG組梭桿菌門的分布高于CSG組，梭桿菌門是口腔微生物群的常見成員。有研究發現梭桿菌屬m能夠引起炎癥，更有學者發現梭桿菌屬m可能與結直腸癌有關。擬桿菌門屬于口腔正常菌群，而擬桿菌門在CAG組的分布低于CSG組，證明梭桿菌屬m、擬桿菌門可能與胃炎的病變程度有關。屬水平上，CAG組卟啉單胞菌屬分布高于CSG組。卟啉單胞菌屬已被證明具有致癌潛力，可抑制細胞凋亡，激活細胞增殖，促進細胞入侵，誘導慢性炎癥，并直接產生致癌物。奈瑟菌屬分布低于CSG組，本結果與既往研究不一致，考慮舌苔菌群的組成和與疾病癥狀有關，如CAG患者癥狀表現以吐酸、噯氣為主，而CSG患者癥狀不明顯，這些癥狀表現都會影響舌苔菌群變化。LEfSe差異分析發現，梭桿菌門在2組差異有統計學意義，且在CAG組的豐度更高，表明CAG患者舌苔菌群結構更加豐富且存在較多優勢菌群，口腔菌群失調程度加重。這些菌屬的改變提示CG的發展可能與炎性因子有關，由于菌群改變，導致代謝物甚至一系列全身系統變化。雖然目前研究缺乏關于特定細菌種類在CG發生發展過程中的確切致炎機制，但在CG患者中觀察到的微生物區系變化豐富了對口腔細菌與CG相關性的認識。

門、屬水平的特定微生物可能為舌診研究指明方向，但仍需更多研究確認特定微生物與舌質和舌苔圖像特征間的關系。或可通過觀察舌象、調整舌苔菌群的方式對胃腸道進行干預和調控，從而干預CG疾病的發展進程。此外，如何將中醫舌診與開發新的生物標志物相結合，用以預測疾病的轉歸、進行辨證論治也是需要關注的問題。