基于FABP4/PPAR-γ/NF-κB信號通路探討芪參湯對非酒精性脂肪性肝病小鼠肝臟炎癥的影響

李琨，王炳予，張雅麗，劉長發，袁星星，3

1.北京開放大學，北京 100081；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150006

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）又稱代謝相關脂肪性肝病，是指除酒精和其他明確的損肝因素外所導致的脂肪組織在肝內堆積過多，出現全身代謝障礙的病理綜合征。非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）屬于NAFLD疾病譜范疇，是由單純性肝臟脂肪變發展而來，以肝內脂質蓄積和大量炎癥細胞浸潤為特征，進而導致肝細胞損傷、壞死和纖維化。目前NAFLD全球發病率約25%，人數已超過17億，且發病率逐年升高，已成為我國第一大慢性肝臟疾病。2019年調查結果顯示，我國NAFLD發病率約29.2%，不僅嚴重危害患者生命健康，也給社會帶來沉重的負擔。

NAFLD發病機制復雜，目前尚缺乏有效的治療藥物。中醫以辨證論治為基礎，對NAFLD的整體調治具有獨特優勢。NAFLD屬中醫學“脅痛”“肝癖”等范疇，多由飲食失節、勞逸失常及情志失暢引起，以致脾失健運，脾氣虛無力運化水谷精微，生化乏源，水谷精微不能正常輸布，致內生痰濕，久之成瘀，痰瘀互結于肝之脈絡發為本病。芪參湯為臨床治療NAFLD的經驗方，由《博愛心鑒》保元湯化裁而來，具有益氣健脾、祛瘀化痰功效。本課題組前期研究表明，芪參湯可通過調控腸道菌群多樣性與穩態，發揮改善NASH患者肝功能、血脂異常和纖維化的作用。藥理實驗結果顯示，芪參湯可通過抑制胰島素通路活化改善NAFLD胰島素抵抗，進而改善肝臟脂肪沉積和肝損傷。本研究以FABP4/PPAR-γ/NF-κB信號通路為切入點，進一步明確芪參湯抑制肝臟炎癥的作用機制，為NAFLD治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 數據來源與處理

采用GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）編號為GSE126848的數據集，該數據集包含57個肝組織樣本，其中14個健康正常體質量樣本、12個肥胖樣本、15個非酒精性肝臟脂肪變樣本、16個NASH樣本。通過R軟件Limma包對數據進行補缺、校正及歸一化。在此基礎上，通過貝葉斯檢驗以＜0.05和|LogFC|≤1為條件對差異基因進行篩選。

1.2 動物及細胞

6周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠100只，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK（京）2016-0011，動物使用許可證號SYXK（黑）2016-008。飼養于黑龍江省中醫藥科學院動物實驗中心，溫度21.5～25.5℃，濕度45.0%～55.0%，12 h光暗循環，自由攝食飲水。小鼠單核巨噬細胞RAW264.7，美國ATCC細胞庫。

1.3 主要試劑與儀器

脂肪酸結合蛋白4（FABP4）抑制劑BMS-309403，美國MCE公司，貨號HY-101903；HE染液、油紅O染液、SYBR Green OneStep qRT-PCR試劑盒，上海碧云天生物，貨號分別為C0105S、C0157M、D7268S；小鼠白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、CXC趨化因子受體3（CXCR3）、趨化因子C-C-基元配體4（CCL4）試劑盒，江蘇酶免實業有限公司，貨號分別為MM-0132M2、MM-0040M2、MM-0153M2、MM-0016M2；細胞核蛋白與漿蛋白抽提試劑盒，福州飛凈生物，貨號PH0710；反轉錄試劑盒，日本TaKaRa公司，貨號RR036A；FABP4抗體、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）-γ抗體、κB抑制因子激酶（IKK）α抗體、核因子（NF）-κB抑制因子（IκB）α抗體、p-IκBα（Ser32）抗體、NF-κB p65抗體、Histone H3抗體、β-actin抗體，美國CST公司，貨號分別為2120、2430、2682、4812、2859、8242、4499、3700；p-IKKα（Ser176）抗 體、HRP標記羊抗兔IgG，英國Abcam公司，貨號分別為ab138426、ab6721；Ly6C抗體、F4/80抗體，美國eBioscience公 司，貨 號 分 別 為14-5931-82、MF48005。CX33光學顯微鏡，日本Olympus公司；Cobas8000全自動生化分析儀，德國Roche公司；電泳儀、電泳槽，美國Bio-Rad公司；iBright CL1500凝膠成像系統、Attune Nx T流式細胞儀、Varioskan LUX多功能酶標儀，美國Thermo Fisher公司。

1.4 藥物及含藥血清制備

芪參湯由黃芪、西洋參、丹參、山楂、荷葉、澤瀉、女貞子、三七、墨旱蓮、絞股藍、甘草按15∶10∶10∶10∶10∶10∶8∶5∶8∶5∶3比例組成，由黑龍江省中醫藥科學院制劑室經浸泡、煎煮、過濾、濃縮后，制成原藥材濃度為1 g/mL濃縮液備用。鹽酸二甲雙胍片，上海上藥信誼藥廠有限公司，0.25 g/片，使用前配制成0.013 g/mL混懸液。

取20只小鼠隨機分為空白組和芪參湯組，每組10只。芪參湯組參照前期研究得出的最佳劑量予芪參湯濃縮液18.8 g/kg灌胃，給藥體積0.376 mL/只。空白組予等體積蒸餾水灌胃，每日1次，連續7 d。末次灌胃后，1%戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉小鼠，腹主動脈采血，3000 r/min離心10 min，取血清，56℃水浴30 min滅活，0.22 μm濾膜過濾后分裝凍存。

1.5 分組、造模及干預

將剩余80只小鼠隨機分為空白組、模型組、芪參湯組和二甲雙胍組，每組20只。除空白組外，其余3組參照文獻[12]采用高脂飼料喂養建立NAFLD小鼠模型。造模同時進行干預，芪參湯組予芪參湯濃縮液18.8 g/kg灌胃，二甲雙胍組予二甲雙胍混懸液0.25 g/kg灌胃，空白組和模型組予生理鹽水灌胃，給藥體積均為0.376 mL/只，每日1次，連續16周。分別于第12、16周末隨機取10只小鼠以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈采血后，分離肝臟，用于后續檢測。以第12周肝組織油紅O染色出現脂滴形成為單純性脂肪變、第16周HE染色可見炎癥細胞浸潤及纖維化為NASH判定標準。

RAW264.7細胞用DMEM高糖培養基（含10%胎牛血清、1%雙抗），置于37℃、5%CO培養箱中培養。取對數生長期細胞，以1×10個/孔接種于96孔板，置于37℃、5%CO培養箱中培養12 h，棄上清液，將細胞分為空白組、模型組、芪參湯組和抑制劑組，每組3個復孔。除空白組外，其余3組加入500 μmol/L棕櫚酸誘導細胞炎癥模型，芪參湯組同時加入100 μL 10%芪參湯含藥血清，抑制劑組加入20 μmol/L BMS-309403，空白組和模型組加入100 μL 10%空白血清，置于培養箱培養24 h，收集細胞和上清液進行檢測。

1.6 檢測指標

1.6.1 肝組織病理觀察

分別于第12、16周取小鼠部分肝臟，中性甲醛固定6 h，石蠟包埋，切片后行HE染色。另取部分肝臟以OCT包埋，冰凍切片，中性甲醛固定30 min，行油紅O染色。光學顯微鏡下觀察，參照文獻[14]方法計算NAFLD活動積分（NAS）。①肝脂肪變評分。肝脂肪變程度＜5%，0分；5%≤肝脂肪變程度≤33%，1分；34%≤肝脂肪變程度≤66%，2分；肝脂肪變程度＞66%，3分。②肝小葉內炎癥評分。肝小葉內炎癥（200倍視野）＜2個，0分；2≤肝小葉內炎癥≤4個，1分；肝小葉內炎癥＞4個，2分。③肝細胞氣球樣變性評分。無肝細胞氣球樣變性，0分；少量肝細胞氣球樣變性，1分；較多肝細胞氣球樣變性，2分。NAS=肝脂肪變評分+肝小葉內炎癥評分+肝細胞氣球樣變性評分。同時，采用Image J 1.8.0軟件計算油紅O染色面積。

1.6.2 肝功能檢測

第12、16周腹主動脈取血，3000 r/min離心10 min，收集血清，全自動生化分析儀檢測血清天冬氨酸氨基轉移酶（AST）和丙氨酸氨基轉移酶（ALT）水平。

1.6.3 ELISA檢測

第12、16周腹主動脈取血，室溫、3500 r/min離心10 min，收集血清。另收集細胞培養上清液，酶標儀測定血清及上清液炎癥因子IL-1β、TNF-α及趨化因子CXCR3、CCL4含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.6.4 Western blot檢測

分別取肝組織和RAW264.7細胞，加入RIPA裂解液，冰上勻漿，3000 r/min離心5 min，取上清液，雙金雞納酸法測定蛋白濃度。取15 μg蛋白上樣，電泳，轉膜，以5%脫脂牛奶封閉1 h，肝組織蛋白樣品滴加FABP4一抗（1∶1000），細胞蛋白樣品滴加FABP4一抗（1∶1000）、PPAR-γ一抗（1∶1000）、p-IKKα一抗（1∶500）、p-IκBα一抗（1∶1000）、IKKα一抗（1∶1000）、IκBα一抗（1∶1000）、β-actin一抗（1∶1000），4℃孵育過夜，加入HRP標記羊抗兔IgG（1∶2000），室溫孵育1 h，滴加超敏ECL顯影液，室溫靜置2 min，采用凝膠成像系統進行掃描分析，以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達量。

另外，通過試劑盒分離細胞質與細胞核蛋白，分別加入NF-κBp65一抗（1∶1000）、HistoneH3一抗（1∶2000）、β-actin一抗（1∶1000），并按上述步驟處理，以Histone H3為細胞核蛋白內參，β-actin為細胞質蛋白內參，計算NF-κB p65蛋白相對表達量。

1.6.5 qRT-PCR檢測

分別取肝組織和RAW264.7細胞，采用Trizol法提取總RNA，根據反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，按SYBR Green OneStep qRT-PCR試劑盒說明書配制反應體系。反應條件：95℃預變性8 min，95℃變性15 s，60℃退火65 s，共40個循環；終末60℃補延伸10 min。以GAPDH為內參，采用2法計算mRNA表 達 量。引 物 序 列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.6.6 流式細胞術檢測

收集各組細胞，3000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀加入Ly6C-PE和F4/80-APC一抗，避光孵育30 min。PBS洗滌，3000 r/min離心5 min，棄上清液，多聚甲醛重懸，流式細胞儀進行檢測。先選取F4/80陽性細胞群，再根據Ly6C熒光強度分為Ly6C和Ly6C巨噬細胞亞群。通過FlowJo 10.4軟件計算各亞群比例。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 差異基因篩選結果

將GSE126848數據集中14個健康正常體質量樣本和12個肥胖樣本定義為Health，15個單純脂肪病變和16個NASH樣本定義為NAFLD。共篩選出1246個差異基因，其中493個上調、753個下調（見圖1）。差異表達基因中，FABP4水平在NAFLD演變過程中逐漸升高，因此本研究主要對FABP4表達及功能展開研究。

圖1 GSE126848數據集NAFLD差異表達基因熱圖

2.2 芪參湯對模型小鼠肝組織病理形態的影響

HE染色和油紅O染色顯示，第12周空白組小鼠肝小葉結構清晰、完整，肝細胞排列整齊；模型組小鼠肝細胞明顯腫脹，呈氣球樣變，有大量脂滴形成；芪參湯組和二甲雙胍組小鼠肝細胞腫脹、氣球樣變及脂質堆積有所改善。第16周模型組小鼠肝小葉結構紊亂，出現大量氣球樣變，炎癥細胞局部浸潤，肝細胞內有大量紅色脂滴；芪參湯組和二甲雙胍組小鼠肝臟脂肪變程度、炎癥細胞浸潤和脂滴較模型組明顯減少。見圖2、圖3。

圖2 各組小鼠肝組織形態（HE染色，×400）

圖3 各組小鼠肝組織形態（油紅O染色，×400）

與空白組比較，模型組小鼠第12、16周NAS和油紅O染色面積顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組和二甲雙胍組小鼠第12、16周NAS和油紅O染色面積顯著減少（＜0.01，＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠不同時點NAS和油紅O染色面積比較（±s）

2.3 芪參湯對模型小鼠肝功能及血清細胞因子的影響

與空白組比較，模型組小鼠第12、16周血清AST、ALT、IL-1β、TNF-α、CXCR3、CCL4含量顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組和二甲雙胍組小鼠 第12、16周 血 清AST、ALT、IL-1β、TNF-α、CXCR3、CCL4含量顯著減少（＜0.05，＜0.01）。見表3、表4。

表3 各組小鼠不同時點肝功能指標比較（±s，U/L）

表4 各組小鼠不同時點血清細胞因子含量比較（±s，pg/mL）

2.4 芪參湯對模型小鼠肝組織脂肪酸結合蛋白4表達的影響

Western blot和qRT-PCR結果顯示，與空白組比較，模型組小鼠第12、16周肝組織FABP4蛋白和mRNA表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組和二甲雙胍組小鼠第12、16周肝組織FABP4蛋白和mRNA表達顯著降低（＜0.01）。見表5、圖4。

表5 各組小鼠不同時點肝組織FABP4表達比較（±s）

圖4 各組小鼠肝組織FABP4蛋白免疫印跡

2.5 芪參湯對RAW264.7細胞上清液細胞因子含量的影響

與空白組比較，模型組細胞上清液IL-1β、TNF-α、CXCR3、CCL4含量增加，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組和抑制劑組細胞上清液IL-1β、TNF-α、CXCR3、CCL4含量減少，差異有統計學意義（＜0.01）。見表6。

表6 各組RAW264.7細胞上清液細胞因子含量比較（±s，pg/mL）

2.6 芪參湯對RAW264.7細胞FABP4/PPAR-γ/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組細胞FABP4、p-IKKα、p-IκBα及細胞核NF-κB p65蛋白表達顯著升高，PPAR-γ、IκBα及細胞質NF-κB p65蛋白表達顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組和抑制劑組細胞FABP4、p-IKKα、p-IκBα及細胞核NF-κB p65蛋白表達顯著降低，PPAR-γ、IκBα及細胞質NF-κB p65蛋白表達顯著升高（＜0.01）。各組IKKα蛋白差異無統計學意義（＞0.05）。見圖5、表7。

表7 各組RAW264.7細胞FABP4/PPAR-γ/NF-κB信號通路相關蛋白表達比較（±s）

圖5 各組RAW264.7細胞FABP4/PPAR-γ/NF-κB通路相關蛋白免疫印跡

2.7 芪參湯對RAW264.7細胞Ly6Clow和Ly6Chigh亞群比例的影響

流式細胞術結果顯示，與空白組比較，模型組細胞Ly6C亞群比例顯著減少，Ly6C亞群比例顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，芪參湯組和抑制劑組RAW264.7細胞Ly6C亞群比例顯著增加，Ly6C亞群比例顯著減少（＜0.01）。見圖6、表8。

表8 各組RAW264.7細胞Ly6Clow和Ly6Chigh亞群比例比較（±s，%）

圖6 各組RAW264.7細胞F4/80-Ly6C檢測流式圖

3 討論

NAFLD發病機制與“二次打擊”密切相關，導致炎癥介質大量產生，進一步引起炎癥壞死及肝纖維化。隨著對NAFLD研究的深入，“多重平行打擊”學說認為，炎癥反應早于單純脂肪變性并且可導致隨后的肝脂肪病變。在炎癥應激作用下，脂質代謝相關調節蛋白功能發生障礙，進一步導致肝細胞內脂質代謝穩態失調，從而引起脂質過度蓄積。本研究通過高脂飼料喂養制備NAFLD小鼠模型，12周即可造成單純性脂肪變，16周可出現典型的NASH病理特征，是目前公認的NAFLD動物模型。結果顯示，模型小鼠血清炎癥因子TNF-α和IL-1β含量增加，并通過體循環進入肝臟，進一步加重肝臟炎癥損傷與糖脂代謝紊亂。芪參湯干預可顯著減少模型小鼠血清炎癥因子TNF-α和IL-1β含量，改善肝臟炎癥和脂質代謝紊亂。

巨噬細胞是固有免疫細胞，可分為常駐枯否細胞和從外周募集的單核細胞源性巨噬細胞。肝臟募集的單核源性巨噬細胞通過循環轉移并浸潤至肝臟組織，通過調節肝臟免疫微環境參與代謝性炎癥，促進NAFLD進展。CXCR3作為CXC趨化因子家族的一員，通過CCL4激活并招募單核巨噬細胞到達炎癥位點，分泌炎癥因子，進一步加重NASH。單核巨噬細胞根據Ly6C水平可分為Ly6C和Ly6C2個亞群，其中Ly6C亞群由Ly6C亞群轉化而來，具有抗炎和促進修復作用，Ly6C亞群在損傷應答及趨化信號中富集，表現為促炎作用。Ly6C和Ly6C亞群比例可作為評估肝臟單核源性巨噬細胞功能的重要指標。本研究中，模型組小鼠血清CXCR3、CCL4含量顯著增加，芪參湯能顯著抑制CXCR3和CCL4分泌，從而抑制單核源性巨噬細胞向肝臟募集。在此基礎上，通過棕櫚酸誘導構建巨噬細胞炎癥模型，流式細胞術結果表明，模型組細胞Ly6C亞群比例減少，Ly6C亞群比例增加，芪參湯干預能顯著促進Ly6C亞群向Ly6C亞群轉化及炎癥因子和趨化因子分泌，發揮抗炎作用。

FABP4主要表達于脂肪細胞和巨噬細胞，表達于脂肪細胞的FABP4具有調控胰島素抵抗及糖脂代謝作用，表達于巨噬細胞的FABP4通過促進內質網應激和炎癥因子分泌發揮促進炎癥反應作用。PPARs屬于核激素受體，包括PPAR-α、PPAR-β和PPAR-γ 3種異構體，在胰島素抵抗、糖脂代謝、炎癥反應及肝纖維化中均發揮重要作用。研究表明，FABP4可直接與PPAR-γ結合并促進PPAR-γ降解，FABP4敲除的巨噬細胞PPAR-γ表達顯著升高。炎癥發生時，IKKα被可游離脂肪酸磷酸化，激活的IKKα進一步磷酸化IκBα/β，使IκBα/β泛素化并被降解，致NF-κB p65和IκBα/β二聚體解離，進而促進NF-κB p65核轉位，調控TNF-α、IL-1β等炎癥因子產生，加重NAFLD發展。PPAR-γ通過抑制激活蛋白-1、NF-κB及JAK/STAT等途徑發揮抑制炎癥反應作用。本研究首先通過生物信息學分析NAFLD差異表達基因，篩選出FABP4進行后續研究。動物實驗結果顯示，NAFLD模型小鼠肝組織FABP4表達顯著上調，芪參湯能顯著抑制模型小鼠肝組織FABP4表達。因此我們推測，芪芪參湯治療NAFLD可能與抑制FABP4表達有關。細胞實驗進一步顯示，模型組RAW264.7細胞FABP4、p-IKKα、p-IκBα和細胞核NF-κB p65蛋白表達顯著升高，PPAR-γ、IκBα和細胞質NF-κB p65蛋白表達顯著降低。芪參湯干預能顯著抑制細胞FABP4、p-IKKα、p-IκBα和細胞核p65蛋白表達，上調PPAR-γ、IκBα和細胞質NF-κB p65蛋白表達，表現出與BMS-309403相同趨勢。以上結果提示，芪參湯抑制炎癥的機制是通過抑制FABP4/PPAR-γ/NF-κB信號通路活化實現的。

綜上所述，芪參湯主要通過抑制FABP4/PPAR-γ/NF-κB信號通路活化，進而促進Ly6C巨噬細胞亞群向Ly6C巨噬細胞亞群轉化，發揮治療NAFLD炎癥的作用。