基于NLRP3炎癥小體探討電針對腦缺血再灌注損傷大鼠細胞焦亡的影響

劉孜琦，聶妍琦，傅旖靈，陸夢，郁潔

湖南中醫藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410036

中風是全球范圍內第二大致死原因，也是導致殘疾的主要因素，其發病率逐年上升，其中大部分為缺血性中風。缺血性中風病理特點是局部腦組織血流量受阻形成梗塞區，恢復缺血腦組織血液供應是缺血性中風治療的主要措施。目前西醫主要采用溶栓治療，但血液再灌注后可導致腦損傷進一步加重，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。研究表明，CIRI早期以炎癥反應為主，CIRI誘導的神經細胞凋亡和神經系統損傷與NLRP3激活密切相關，抑制NLRP3介導的細胞焦亡能發揮神經保護作用。課題組前期研究顯示，電針可改善缺血再灌損傷模型大鼠神經功能，抑制神經細胞凋亡，發揮神經保護作用。本研究通過大腦中動脈栓塞（MCAO）大鼠模型，進一步探討電針是否通過抑制NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡發揮神經保護作用，為明確電針治療缺血性中風的作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物

9～10周齡健康SPF級雄性SD大鼠60只，體質量（230±30）g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產許可證號SCXK（湘）2019-0004。分籠飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心，溫度24～26℃，相對濕度50%～70%，12 h光/暗循環，自由攝食飲水。使用許可證號SCXK（湘）2019-0009。實驗過程嚴格按照《關于善待實驗動物的指導性意見》進行。

1.2 藥物及試劑

依達拉奉注射液，1.5 mg/mL，貨號H20080056，安徽國藥集團國瑞藥業有限公司。4%多聚甲醛，貨號BL539A，北京白鯊易科技有限公司；戊巴比妥鈉，貨號P3761，上海Sigma-Aldrich；BCA蛋白濃度測定試劑盒，貨號PC0020，北京Solarbio；SYBR FAST qPCR Master Mix，貨 號KM4101，上 海KAPA Biosystems；蛋白Marker，貨號P12103，深圳Helix；化學發光試劑，貨號WBKLS0500，上海Millipore；PVDF膜，貨號IPVH00010，上海Millipore；吐溫-20，貨號T8220-100，北京Solarbio；RIPA組織細胞快速裂解液，貨號R0010，北京Solarbio；NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、白細胞介素（IL）-1β、GAPDH、Goat anti-Rabbit IgG抗體，貨號分別為PAB37930、PAB44625、PAB39968、PAB36269、SAB43714，武漢Bioswamp；伊紅，貨號E8090，北京Solarbio；蘇木素，貨號G1004，武漢Servicebio；中性樹脂，貨號G8590，北京Solarbio。

1.3 主要儀器

一次性實驗針灸針（0.30 mm×25 mm，蘇州醫療用品有限公司），栓線（型號2634-50A4，北京西濃有限公司），電針治療儀（型號SDZ-Ⅱ，蘇州醫療用品廠有限公司），正置顯微鏡（型號DM1000，上海徠卡顯微系統有限公司），恒溫烘箱（型號DHG-9023A，上海一恒科學儀器有限公司），石蠟切片機（型號RM2235，上海徠卡顯微系統有限公司），生物組織包埋機-冷凍機（型號TB-718L，湖北泰維科技），電泳儀（型號Mini Protean 3 Cell，上海Bio-Rad），酶標儀（型號MK3，芬蘭雷勃），干式恒溫器（型號K30，杭州爽盛儀器），高速冷凍離心機（型號iCEN-24R，杭州奧盛），全自動化學發光分析儀（型號Tanon-5200，上海天能），PCR儀（型號GE48527，杭州柏恒），熒光定量PCR儀（型號CFX-Connect 96，上海Bio-Rad），超微量分光光度計（型號Nano-300，杭州奧盛）。

1.4 分組及造模

大鼠適應性喂養1周后進行實驗，按隨機數字表法將60只大鼠分為空白組、模型組、電針組和依達拉奉組，每組15只。除空白組外，采用Longa改良線栓法制備MCAO模型，術前12 h禁食不禁水，1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射（30 mg/kg）麻醉大鼠，仰臥位固定于鼠板，剃除頸部毛發，消毒皮膚，頸部正中切開皮膚，沿胸鎖乳突肌內緣用止血鉗鈍性分離皮下筋膜、肌肉及腺體，充分暴露右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，用玻璃分針分離頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈及迷走神經，分別在頸內動脈、頸外動脈掛線備用。結扎頸外動脈近心端，用顯微動脈夾暫時夾閉頸內動脈和頸總動脈，在距頸總動脈分叉3 mm處剪一“V”形小口，將栓線由“V”型小口插入頸總動脈至頸內動脈，松開頸內動脈及頸總動脈處顯微動脈夾，繼續將栓線插入頸內動脈約（18.5±0.5）mm至微感阻力，將頸內動脈遠心端處手術線結扎，用以固定栓線。逐層縫合傷口，碘伏消毒傷口及周圍皮膚，栓線另一端留l cm置于體外，術后腹腔注射青霉素鈉（20萬U/只）預防感染。缺血90 min后撤去栓線實現再灌注。空白組只暴露頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈及迷走神經，不插入栓線。

大鼠蘇醒后根據文獻[10]標準進行神經功能缺損評分：0分，無神經缺損癥狀；1分，不能完全伸展左前肢；2分，走路時身體轉向偏癱側；3分，行走時身體向偏癱側傾倒；4分，不能自主行走，意識喪失。分別于蘇醒后0、24、48 h進行評分，將首次評分為1～3分的大鼠納入實驗。

1.5 干預

電針組參照《實驗針灸學》進行腧穴定位，選取左側“內關”“百會”，用0.30 mm×25 mm針灸針30°斜刺2 mm，正極接左側“內關”，負極接“百會”，連接電針治療儀。刺激參數：疏波10 Hz、密波50 Hz，脈沖寬度0.5 ms，電流1 mA。電針組大鼠造模生命體征平穩后（約2 h）進行第1次電針，隨后每隔12 h電針1次，20 min/次，共5次。模型組和依達拉奉組在相同時段予固定操作20 min。依達拉奉組大鼠在造模蘇醒后即刻一次性腹腔注射依達拉奉注射液（3 mg/kg），模型組和電針組注射等量生理鹽水。

1.6 指標檢測

1.6.1 HE染色

干預結束后，每組選取3只大鼠，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，斷頭取腦，切取0.3 cm×0.3 cm大小腦組織，放入4%多聚甲醛中固定48 h，乙醇梯度脫水，浸蠟包埋，切片（厚度3 μm），每只大鼠選取3張切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察，Leica Application Suite圖象系統采集圖像，觀察大腦皮層梗死區病理改變。

1.6.2 TUNEL染色

將固定好的大鼠腦組織常規脫水浸蠟包埋，連續切片（2 μm），水浴展片及烤片，脫蠟處理后，不同濃度酒精水化，滴加Protein K工作液，37℃孵育15 min，加入50 μL TUNEL反應混合液，濕盒避光37℃加蓋孵育60 min，PBS沖洗3次，加入50 μL POD-conjugated Anti-FITC工作液，濕盒37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，加入50 μL DAB底物，室溫孵育10 min，蘇木素復染，脫水，透明，封片。光學顯微鏡下觀察，以棕黃色顆粒為凋亡陽性表達，每張切片隨機選取5個視野，使用Image Pro Plus 6.0軟件統計每個視野中凋亡陽性細胞數及細胞總數，計算細胞凋亡率（凋亡陽性細胞數÷細胞總數×100%）。

1.6.3 Western blot檢測

剪取200 mg凍存腦組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，4℃、12000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，樣品與5×上樣緩沖液混合，100℃加熱5 min變性；配制12%分離膠、5%濃縮膠進行電泳，20 μg/孔上樣，濃縮膠80 V、40 min，分離膠120 V、50 min，當溴酚藍到達分離膠底部時結束電泳；4℃、100 mA轉膜50 min；5%脫脂奶粉4℃封閉過夜；加入NLRP3、Caspase-1、IL-1β、GAPDH一抗（均為1∶1000），室溫孵育1 h；TBST洗膜15 min×3次，滴加HRP標記山羊抗兔IgG（1∶10000），室溫孵育1 h；TBST洗膜15 min×3次，滴加ECL化學發光液顯色曝光，將膜置于全自動化學發光分析儀中檢測，采用TANON GIS軟件讀取蛋白條帶灰度值。

1.6.4 RT-PCR檢測

取100 mg腦組織，加入1 mL Trizol研磨成勻漿，12000 r/min離心15 min，提取組織總RNA，按照說明書進行反轉錄，將cDNA進行PCR擴增：95℃預變性3 min，95℃變性5 s，59℃退火10 s，72℃延伸25 s，共40個循環。采用CFX Manager 3.1軟件獲取Ct值，以GAPDH為 內 參，2法 計 算NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對表達量。PCR引物由武漢天一華煜基因科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 電針對模型大鼠神經功能缺損評分的影響

造模后0 h，各組大鼠神經功能缺損評分較空白組均顯著升高（＜0.01），提示造模成功；與模型組比較，電針組和依達拉奉組大鼠造模后24、48 h神經功能缺損評分顯著降低（＜0.05，＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠造模后不同時點神經功能缺損評分比較［M（Q1，Q3），分］

2.2 電針對模型大鼠大腦皮層病理變化的影響

HE染色結果顯示，空白組大鼠大腦皮層神經元密集、排列規則，胞質豐富，核仁明顯，未見病理損傷；模型組大鼠大腦皮層神經元排列紊亂，染色質皺縮，胞體膨大變形，部分可見細胞膜破裂，有空泡，周圍尼氏體消失，部分神經細胞萎縮及壞死，有大量小膠質細胞，微血管增多；電針組大鼠大腦皮層病變情況較模型組減輕，細胞排列較整齊，少量神經細胞壞死，神經細胞形態有明顯改善，有少量小膠質細胞；依達拉奉組大鼠大腦皮層病理損傷較模型組顯著減輕，神經細胞排列整齊、結構清晰，胞漿豐富。見圖1。

圖1 各組大鼠大腦皮層形態（HE染色，×400）

2.3 電針對模型大鼠腦組織細胞凋亡的影響

TUNEL染色結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠腦組織細胞凋亡率顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，電針組和依達拉奉組大鼠腦組織細胞凋亡率顯著降低（＜0.01）。見表3、圖2。

圖2 各組大鼠腦組織凋亡陽性表達（TUNEL染色，×200）

表3 各組大鼠腦組織細胞凋亡率比較（±s，%）

2.4 電針對模型大鼠腦組織NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1、白細胞介素-1β蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，電針組和依達拉奉組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達顯著降低（＜0.01），且依達拉奉組各指標低于電針組，差異有統計學意義（＜0.05，＜0.01）。見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白免疫印跡

圖4 各組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達比較（±s，每組15只）

2.5 電針對模型大鼠腦組織NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1、白細胞介素-1β mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達顯著升高（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，電針組和依達拉奉組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達顯著降低（＜0.05，＜0.01），且依達拉奉組各指標低于電針組，差異有統計學意義（＜0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達比較（±s，每組15只）

3 討論

缺血性中風病因主要為風、火、痰、瘀、虛，病機多屬本虛標實。《醫林改錯》有“無氣則不能動，不能動，名曰半身不遂，不遂者，不遂人用也”，將中風表現的臨床癥狀歸于氣虛不達所致。現代研究表明，元氣虧損是缺血性腦卒中的主要原因，氣行則血行，氣為血之帥，因此氣虛則血虛，脈道失榮。《針灸大成》有“中風將至，病淺癥輕，時發時止，若有若無，其因不明，此時若施以針灸，投以重劑，恐傷氣血，又慮虛實之誡，誤釀痼疾”，強調中風的病性為本虛標實，以虛為主，忌投以重劑。

本實驗參考前期研究選取“百會”“內關”進行電針干預，進一步揭示電針對缺血再灌注損傷模型大鼠的保護機制。百會為諸陽之會，督脈要穴，全身各部陽氣皆匯集于此，《會元針灸學》有“百會者，五臟六腑奇經三陽百脈之所會”，刺激百會可調動百脈之氣，補陽調陰。研究發現，百會具有醒神開竅、益精調神作用。百會位于巔頂，百會之下則為腦，《本草綱目》“腦為元神之府”，而心主神志，心藏神，心腦同治也。“人之元神藏于腦，人之識神發于心”（《醫學衷中參西錄》），故取手厥陰心包經穴內關相配，手厥陰心包經起于胸中，出屬心包絡，下膈，歷絡三焦。內關為八脈交會穴、絡穴之一，常用于治療心臟疾病及部分神志病證，具有寧心定志作用。且內關與陰維脈相通，通過絡脈與三焦貫通，調理三焦氣機，運行氣血，故針刺內關可調心以醒腦。百會、內關二穴相配，可達開竅醒神、活血祛風之功。本研究中，電針干預后模型大鼠神經功能缺損評分顯著低于模型組，且與依達拉奉組無明顯差異。HE染色顯示，模型組大鼠大腦皮層神經細胞排列紊亂，細胞萎縮及壞死，神經元核固縮及變形，電針組大鼠腦組織病理損傷明顯減輕，提示電針能降低大鼠腦組織損傷，改善神經細胞形態，發揮神經保護作用。

CIRI發病機制復雜，炎癥反應和細胞焦亡是其過程中的關鍵環節，其中，炎癥反應在CIRI早期發揮重要作用。NLRP3炎癥小體是腦血管疾病產生的最廣泛的復合小體之一，在大腦中大量表達，能夠識別缺血性中風期間細胞損傷，并調節缺血再灌注損傷引起的炎癥反應。NLRP3炎癥小體由NLRP3（3個結構域及NLR寡聚化形成炎癥小體的核心結構）、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和半胱天冬酶-1前體（pro-Caspase-1）組成，可以增加促炎細胞因子的產生和分泌，導致細胞凋亡和細胞焦亡的程序性死亡。細胞焦亡作為具有炎癥性特點的細胞死亡形式，可介導炎癥反應的發生，加劇CIRI。細胞焦亡依賴于經典的Caspase-1通路，細胞內的模式識別受體作為感受器識別細胞外信號，通過接頭蛋白ASC與pro-Caspase-1結合，形成多蛋白復合物，使Caspase-1活化。活化的Caspase-1一方面對IL-1β和IL-18的前體進行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外，募集炎癥細胞，擴大炎癥反應；另一方面切割Gasdermin D，形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段，誘導細胞膜穿孔，細胞破裂，導致細胞焦亡。NLRP3是細胞焦亡的關鍵蛋白，可與ASC相互作用，招募pro-Caspase-1，通過上述Caspase-1經典焦亡通路，將焦亡信號傳遞到下游焦亡蛋白，最終發生細胞焦亡。TUNEL染色觀察顯示，電針可抑制模型大鼠腦組織細胞凋亡，但由于TUNEL染色是細胞凋亡的主要評價方法，無法特異性評價焦亡情況，因此通過Western blot和PCR實驗，進一步檢測焦亡相關分子的表達。結果表明，模型組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白和mRNA表達顯著升高，提示出現細胞焦亡；電針組大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白和mRNA表達顯著降低，推測電針可能通過抑制NLRP3炎癥小體阻止Caspase-1活化，減少促炎因子IL-1β的分泌，抑制細胞焦亡。

綜上，電針“百會”“內關”對腦缺血再灌注損傷大鼠可發揮神經保護作用，其機制可能與抑制NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡，減輕CIRI有關。但電針對NLRP3炎癥小體的具體抑制途徑及對其他細胞焦亡通路的調節作用仍有待今后深入研究。