可移植人髓母細胞瘤PUMC-MBT1瘤株的建立與鑒定

王世尊，張 丹，葛 明，馮海涼，劉玉琴*

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 1.病理學系; 2.細胞中心，北京 100005； 3.首都醫科大學附屬北京兒童醫院 國家兒童醫學中心 神經外科， 北京 100045)

髓母細胞瘤(medulloblastoma)是一種常見的后顱窩惡性胚胎性腫瘤，好發于兒童[1]。由于中國小兒神經外科起步較晚，全國范圍內能開展小兒神經外科的醫院較少[2]，因此兒童神經腫瘤組織標本十分珍貴。另外目前對髓母細胞瘤生物學行為的認識和治療方法的探索仍存在較大的困難，其主要原因在于髓母細胞瘤發生、發展等內在機制研究尚不充分，且髓母細胞瘤可用的實驗模型較少，因此建立更多的髓母細胞瘤細胞和動物模型顯得尤為重要[3]。目前用于研究髓母細胞瘤的實驗模型主要為細胞模型和動物模型，其中細胞模型主要包括連續傳代細胞系[4]和類器官培養[5]，動物模型主要包括細胞系來源的異種種植腫瘤(cell-line-derived xenograft, CDX)[6]、患者來源的異種種植腫瘤(patient-derived xenograft, PDX)[7]以及基因編輯模型小鼠(genetically enginee-red mouse models, GEMMs)[8]等。其中連續傳代細胞系、CDX模型和PDX模型應用較為廣泛。PDX模型雖較CDX模型更接近患者情境，如腫瘤細胞的多樣性等，但構建過程相對CDX模型更加繁瑣，成功率較低并且較難獲得穩定的株系[3]。本研究通過接種人髓母細胞瘤細胞系PUMC-MB1，構建了一個可在小鼠體內連續穩定傳代的可移植瘤模型——PUMC-MBT1瘤株，旨在為髓母細胞瘤研究提供易于構建、特征穩定的體內研究工具。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞系

SPF級SCID雄性和雌性小鼠，4～5周齡，體質量16～18 g(北京華阜康生物科技有限公司[SCXK(京)2019-0008])。本研究體內實驗遵循中國醫學科學院基礎醫學研究所動物倫理要求及福利飼養，環境采用12 h/ 12 h光照/黑暗條件，小鼠自由飲水、采食，并遵循“3R”原則[減量化(reducing)]，再利用(resusing)和再循環(recycling)三種原則進行實驗。人髓母細胞瘤細胞系PUMC-MB1為本課題組自建髓母細胞瘤細胞系，經鑒定為經典型髓母細胞瘤。本研究使用的為自液氮復蘇的第40代細胞[PUMC-MB1(P40)]。腫瘤CDX模型構建和傳代均在生物安全柜中進行。

1.2 試劑與儀器

一抗：anti-NeuN(貨號：#ABN78)(Millipore公司)；anti-Syn(貨號：#36406)、anti-H2K27M(貨號：#74829)、anti-MUC1(貨號：#4538)(CST公司)；anti-Ki-67(貨號：ab16667)、anti-GFAP(貨號：ab7260)、anti-CK(AE1/AE3) (貨號：ab80826)、anti-S100(貨號：ab52642)(Abcam公司)；二抗：通用二步法檢測試劑盒(貨號：PV-9000)、抗體稀釋液、DAB顯色試劑盒及蘇木精-伊紅(HE)染料(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 髓母細胞瘤移植瘤瘤株建立

復蘇培養PUMC-MB1(P40)細胞，于體外培養至對數生長期后，收集細胞，離心并用PBS重懸為5×107個/mL的單細胞懸液，于SCID小鼠右側腋窩皮下接種細胞懸液0.1 mL，雄性小鼠5只和雌性小鼠5只，待皮下腫瘤(P0)長徑增長至1.5 cm時，麻醉后處死小鼠，取出腫瘤并置于PBS中，剪除外周纖維組織、血管及中心壞死組織，將剩余魚肉樣腫瘤組織剪碎并充分研磨后用PBS重懸，細胞濃度為5×107個/mL，細胞懸液0.1 mL接種于每只小鼠的右側腋窩皮下，體內移植瘤命名為PUMC-MBT1，并記作P1。重復上述步驟連續于體內傳代10次，每次雄性小鼠2只和雌性小鼠2只，分別記作P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9，第10代為10只(5只雄性、5只雌性)小鼠。記錄第10代移植瘤模型腫瘤生長情況、荷瘤小鼠體質量以及生存情況，留取腫瘤組織用于后續病理學檢查。

1.4 髓母細胞瘤移植瘤體內生長的觀察

PUMC-MBT1移植后每3 d觸摸小鼠皮下有無瘤性結節，記錄小鼠體質量。如觸及腫瘤，用游標卡尺測量腫瘤長徑(L)和短徑(S)，并按照公式V(mm3)=L(mm)×S(mm)2/2計算腫瘤體積。

1.5 髓母細胞瘤移植瘤特性鑒定

PUMC-MBT1(P10) 腫瘤組織經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，行HE染色，并進行Ki-67、Syn、NeuN、GFAP、S-100、H3K27M、MUC1、CK(AE1/AE3)免疫組化染色。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 髓母細胞瘤PUMC-MBT1移植瘤模型建立情況

PUMC-MB1細胞系接種25 d左右可在皮下觸及結節，40 d后腫瘤長徑達到1.5 cm左右。PUMC-MBT1細胞株從P1傳至P9，各代雄性小鼠和雌性小鼠成瘤率均為100%，25～35 d傳代1次。第10代雄性小鼠(n=5)和雌性小鼠(n=5)皮下成瘤率見圖1。P10在接種后第14天可在皮下觸及結節，29 d后腫瘤長徑達到1.5 cm左右。腫瘤生長曲線可見腫瘤生長的4個階段：0～14 d為潛伏期、15～29 d為快速生長期、30～41 d為死亡前期、42～58 d為死亡期(圖2)。同一時間點，雄性小鼠和雌性小鼠之間腫瘤體積差異無統計學意義(圖2A)。荷瘤小鼠體質量穩定增長，同一時間點，雄性小鼠和雌性小鼠體質量差異無統計學意義(圖 2B)。荷瘤雄性小鼠生存時間為(46.0±2.8)d (n=5)，荷瘤雌性小鼠生存時間為(54.8±3.1)d (n=5)，雄雌小鼠荷瘤生存時間差異無統計學意義(圖 2C)。

The first line: male tumor-bearing mice; the second line: female tumor-bearing mice圖1 PUMC-MBT1細胞的成瘤性驗證Fig 1 Tumorigenicity of PUMC-MBT1 cells(n=5)

A.growth curve of transplanted tumors of male/female mice at passage 10; B.body weight of tumor-bearing male/female mice at passage 10; C.survival curve of tumor-bearing male/female mice at passage 10

2.2 髓母細胞瘤PUMC-MBT1移植瘤病理形態學觀察

PUMC-MBT1移植瘤肉眼觀形態相對規則，呈圓形或橢圓形，腫瘤表面有包膜，與周圍組織邊界清晰，周圍有供血血管(圖3A)，腫瘤實質為魚肉樣，質韌(圖3B)。解剖小鼠腦、肝臟、脾、肺臟、胰腺和腎，肉眼未見轉移灶。HE切片觀察可見腫瘤由高度密集的小細胞構成，細胞胞質少，核大且深染，呈圓形或卵圓形，高倍鏡下可見多個核仁以及多核分裂象(圖 3C)，與患者原發灶組織病理學一致(圖3D)。

A.general view of transplanted tumor; B.section view of transplanted tumor; C.HE image of transplanted tumor; D.HE image of original tumor (scale bar=100 μm)

2.3 髓母細胞瘤PUMC-MBT1移植瘤特異性分子表達情況

腫瘤免疫組化染色可見Ki-67陽性(80%～90%)，Syn陽性(40%～50%)，NeuN陽性(20%～30%)，GFAP、S-100、H3K27M、MUC1、CK(AE1/AE3)陰性(圖4)。

圖4 PUMC-MBT1免疫組化染色Fig 4 Immunohistochemical images of PUMC-MBT1(scale bar=50 μm)

3 討論

隨著神經外科和放化療技術的進步，接受多學科綜合治療的髓母細胞瘤患者中60%～80%可達到長期生存[9]，但是高危組患者預后仍較差[1]。因此為了更好地支持髓母細胞瘤的研究，本研究通過接種人髓母細胞瘤細胞系PUMC-MB1構建了一個可在小鼠體內連續穩定傳代的可移植髓母細胞瘤模型PUMC-MBT1。

PUMC-MBT1移植瘤與人髓母細胞瘤的病理特征特性一致，是人髓母細胞瘤體內研究的理想模型。PUMC-MBT1來源于本課題組自建人髓母細胞瘤細胞系PUMC-MB1的CDX模型，經過小鼠體內連續傳代，很好地適應了小鼠體內環境，生長(潛伏期、生長速度、荷瘤壽命)特性等已穩定，與CDX模型相比，成瘤潛伏期明顯縮短，由25 d縮短至14 d，快速生長期時間相近，成瘤率100%。生長速度適中，荷瘤小鼠存活時間50 d左右，一批體內研究可在30 d左右得到結果。移植瘤組織病理學特征與患者原發灶組織病理學結果保持一致，均為經典型髓母細胞瘤，免疫組化染色顯示髓母細胞瘤特異表達分子Syn和NeuN為陽性，GFAP、S-100、H3K27M、MUC1、CK(AE1/AE3)均為陰性，與星型膠質細胞瘤和室管膜瘤等可鑒別。表明PUMC-MBT1細胞可作為髓母細胞瘤體內研究工具。

可移植瘤瘤株建立體內腫瘤研究模型比CDX/PDX具有突出的優勢。腫瘤研究中，體外培養連續細胞系的優勢在于可以進行基因操作，驗證信號通路等分子機制，可以觀察藥物等影響因素對腫瘤細胞直接的作用。與體內環境相比，體外培養環境簡單、條件易控。但是，體外培養很難體現真實發生在體內的腫瘤的方方面面。所以在藥物研究過程中，利用動物體內實驗模型進行的藥效學驗證是無法逾越的階段。CDX在多組體內研究時，比如需要50～60只動物接種時，需要培養大量的細胞，細胞培養操作復雜、耗時長且昂貴。根據腫瘤類型和使用小鼠種類的不同，PDX模型成功率不同，對于中樞神經系統腫瘤，據報道使用SICD小鼠構建PDX模型平均成功率僅50%左右[10]。人的腫瘤組織第一次移植到小鼠體內，潛伏很長、且不確定[11]。第一代移植的腫瘤，首先在數量上往往也不能滿足多組研究的需要，需要多次在動物體內傳代，才能獲得足量腫瘤；其次，在這個過程中腫瘤細胞多樣性在傳代后能否保留，也是未知數，缺乏研究[12]。而使用瘤株的移植瘤模型，在動物體內傳代后，克服了上述種種缺點，保留了腫瘤最主要的特性，獲得了穩定的預期。瘤株可在液氮中長期儲存，使用時復蘇建模，是理想的腫瘤實驗研究模型。

綜上所述，PUMC-MBT1細胞具有穩定傳代的特性，是髓母細胞瘤良好的體內研究工具。