富馬酸氯馬斯汀減輕小鼠腸缺血/再灌注損傷

劉 洋，錄亞鵬，郝 偉，鐘海蓮，劉婕婷，王迎斌

(蘭州大學第二醫(yī)院 麻醉科， 蘭州大學 第二臨床醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730030)

腸缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷又稱再灌注損傷是臨床常見的病理生理過程。由此引起的臨床疾病稱為再灌注綜合征。腸I/R誘發(fā)的局部和全身炎性反應可造成多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，病死率達30%～90%[1]。據(jù)報道，腸組織內(nèi)NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小體活化半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)并伴有大量促炎性因子釋放誘發(fā)的促炎性程序性細胞死亡方式，在腸I/R的病理生理過程中起著關(guān)鍵作用[1]。抑制NLRP3炎性小體的激活可抑制I/R引起的腸道炎性反應，減輕腸損傷[2]。因此NLRP3炎性小體可能是腸I/R損傷的有效治療靶點。

富馬酸氯馬斯汀(clemastine fumarate，CLE)，是組胺1受體(histamine 1 receptor，H1R)拮抗劑，主要參與機體變態(tài)反應。有報道CLE能抑制炎性反應，減輕器官缺血再灌注損傷[3-4]，但其對腸I/R損傷過程中的機制尚不清楚。本研究擬觀察CLE是否影響小鼠腸I/R損傷及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

1.1.1 動物：SPF級Balb/c小鼠24只，體質(zhì)量18～25 g，雄性(中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心)。

1.1.2 試劑：CLE(上海藍木化工有限公司)；TNF-α、IL-18及IL-1β ELISA試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司)；NLRP3抗體(Abcam公司)；Caspase-1抗體和消皮素D(gasdermin D，GSDMD)抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；蛋白酶抑制劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL發(fā)光液(Millipore公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物的分組及處理：小鼠隨機分為假手術(shù)組(sham組)、I/R組和CLE組，每組8只。CLE組術(shù)前1 h腹腔注射CLE 5 mg/kg。建立腸系膜上動脈分支夾閉模型(缺血40 min，再灌注2 h)[5]。Sham組小鼠行相同手術(shù)但不做夾閉處理。異氟醚麻醉，眼眶靜脈采血。過量麻醉致死收集盲腸上5 cm 缺血/再灌注腸組織。

1.2.2 腸組織病理檢測：小腸組織石蠟包埋切片，HE染色。光鏡下觀察腸黏膜病理變化。采用Chiu’s評分：正常為0分；絨毛頂端上皮下間隙增寬為1分；絨毛頂端上皮下間隙進一步擴大，絨毛尖端上皮抬高與固有膜剝離為2分；絨毛上皮成塊脫落為3分；上皮完全脫落，僅有固有膜為4分；固有膜層崩裂，出現(xiàn)出血與潰瘍?yōu)?分。

1.2.3 ELISA檢測血清炎性因子：眼眶靜脈取靜脈血樣800～1 000 μL，室溫靜置1h，離心，分離血清。按ELISA試劑盒說明檢測和計算血清TNF-α、IL-1β及IL-18水平。

1.2.4 Western blot檢測NLRP3、caspase-1及GSDMD蛋白表達：按照常規(guī)方法檢測并分析腸組織NLRP3、caspase-1及GSDMD蛋白的表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 腸黏膜病理改變

Sham組腸黏膜完整，絨毛直立排列整齊；I/R組絨毛頂部結(jié)構(gòu)大片缺失，絨毛失去基本結(jié)構(gòu)，大量炎性細胞浸潤，紅細胞淤積；CLE組絨毛結(jié)構(gòu)基本存在，但絨毛出現(xiàn)倒伏，Gruenhagen’s間隙擴大，小部分絨毛頂端有缺失，伴較多炎性細胞浸潤。與sham組相比，I/R組和CLE組Chiu’s評分明顯升高(P<0.05)；與I/R組相比，CLE組Chiu’s評分顯著降低(P<0.05)(表1，圖1)。

表1 各組小鼠腸黏膜病理Chiu’s評分結(jié)果

圖1 各組小鼠腸組織HE染色Fig 1 Intestinal tissues of mice in various groups by HE (×40，×100)

2.2 血清TNF-α、IL-1β及IL-18含量

與sham組相比，I/R組及CLE組血清TNF-α、IL-18及IL-1β明顯升高 (P<0.05)； 與I/R組相比，CLE組血清TNF-α、IL-18及IL-1β顯著降低(P<0.05)(表2)。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-18含量

2.3 腸組織NLRP3、caspase-1及GSDMD蛋白表達水平

與sham組相比，I/R組缺血再灌注腸組織NLRP3、caspase-1及GSDMD蛋白表達量明顯上升(P<0.05)； 與I/R組比較， CLE組缺血再灌注腸組織NLRP3、caspase-1及GSDMD蛋白表達量顯著降低(P<0.05)(圖2)。

A.expression of NLRP3, caspase-1 and GSDMD proteins by Western blot; B.bar graph of NLRP3, caspase-1 and GSDMD proteins expression;*P<0.05 compared with sham group； #P<0.05 compared with I/R group

3 討論

H1R在小腸黏膜中廣泛分布，其激活可加速氧自由基的生成，誘導中性粒細胞聚集，介導炎性反應加重腸組織損傷[6]。H1R拮抗劑可以抑制肥大細胞(mast cell，MC)脫顆粒作用，減少組胺和促炎性細胞因子的釋放[3]。大鼠腸I/R模型中抑制MC脫顆粒，可抑制腸道炎性反應，減輕腸組織損傷[7]。本實驗觀察到，CLE降低腸黏膜損傷Chiu’s評分，提示CLE可減輕I/R腸黏膜損傷。

激活的NLRP3炎性小體通過活化caspase-1切割GSDMD，致GSDMD的N端結(jié)構(gòu)域在質(zhì)膜中形成孔洞，釋放細胞內(nèi)大量IL-1β和IL-18，進而引發(fā)細胞死亡裂解， 發(fā)生爆發(fā)性的炎性反應[8]。NLRP3炎性小體在腸早期再灌注2～4 h發(fā)生漸進激活，相關(guān)的Chiu’s評分和炎性細胞因子也隨之明顯上升[1]。本實驗觀察到CLE降低了腸組織NLRP3、caspase-1及GSDMD細胞焦亡相關(guān)蛋白的表達，并下調(diào)血清TNF-α、 IL-1β及IL-18炎性細胞因子的含量，提示CLE可能通過抑制I/R腸組織NLRP3炎性小體的激活, 從而減輕腸道炎性反應。

病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated mole-cular patterns，PAMPs)可活化NF-κB通路，上調(diào)NLRP3和IL-1β表達；多種PAMPs和損傷相關(guān)分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)則促進NLRP3炎性小體的組裝與激活。本研究觀察到CLE減少I/R腸組織NLRP3炎性小體的表達。據(jù)報道，CLE可抑制器官I/R中Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)的表達[3,9]。TLR4可通過MyD88激活NF-κB依賴性和非依賴性途徑, 導致NLRP3表達增加[10]。抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，有效減輕腸I/R損傷[11]。腸I/R還可誘導大量MC活化并造成TLR4、NF-κB和TNF-α的過表達[12]，MC脫顆粒促進劑compound40/80可促進NLRP3炎性小體的表達，而給予MC膜穩(wěn)定劑則出現(xiàn)相反的結(jié)果[7]。因此推測CLE抑制了NLRP3炎性小體的激活可能與抑制TLR4的表達和/或抑制MC脫顆粒相關(guān)。

綜上所述，第二代H1R拮抗劑CLE，減輕腸I/R損傷，其機制可能通過抑制腸組織NLRP3炎性小體激活。進一步探討CLE調(diào)控NLRP3炎性小體的機制可為腸I/R的防治提供新的實驗基礎(chǔ)。