miR-501通過下調eIF4E3促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲

黃金麗，關宏偉，盧 穎，侯 力，黃玉紅，張晴晴，宋 波

2018年最新統計顯示，我國胃癌死亡人數約占全球胃癌死亡的一半[1]。單鏈非編碼microRNAs(miRNAs)長度為19～25個核苷酸，其可結合相關靶基因mRNA的3′-UTR區域，改變mRNA的穩定性或調控其翻譯。編碼hsa-miR-501-5p(miR-501)的基因位于X染色體上，有文獻報道miR-501在胃癌細胞和組織中表達增高[2-3]，可靶向Wnt/β-catenin信號通路的抑制因子DKK1、NKD1和GSK3β，促進胃癌干細胞樣表型，與胃癌較差的預后有關[2]，也可靶向LPAR1促進胃癌細胞增殖和遷移[3]。eIF4E3是真核翻譯起始因子4E家族的第3個成員，現有研究提示eIF4E3在急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)、頭頸部鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of head and neck,HNSCC)中起抑癌作用[4-5]，eIF4E3高表達也與乳腺癌良好生存率有關[6]。經miRNA分析軟件TargetScan預測，eIF4E3是miR-501的潛在靶點。因此，miR-501可能通過下調eIF4E3表達，參與調控胃癌細胞的惡性生物學行為。本文通過體外細胞實驗探討miR-501對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及其對eIF4E3表達的靶向調控，以期為胃癌診斷、治療提供新的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料人胃黏膜上皮細胞GES-1和胃癌MGC-803細胞，購自上海生命科學研究院細胞資源中心。SGC-7901細胞由空軍軍醫大學西京醫院消化內科惠贈，BGC-823細胞為大連醫科大學解剖學教研室李巖教授贈予。RPMI-1640、DMEM高糖培養基和胎牛血清(FBS)，均購自美國Gibco公司。Lipofectamine 2000、TRIzol試劑、eIF4E3引物，購自美國Invitrogen公司。miR-501 mimic購自廣州銳博生物公司；siRNA eIF4E3購自蘇州吉瑪基因公司；eIF4E3 3′-UTR野生型及突變型載體，購自上海吉凱基因公司。miR-501引物購自美國Applied Biosystems公司；eIF4E3多克隆抗體購自美國Signalway Antibody(SAB)公司；Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit和TaqMan Universal Master Mix II，購自美國Applied Biosystems公司。PrimeScript RT Reagent Kit和TB Green Premix Ex Taq II，均購自大連Takara公司。雙熒光素酶報告系統，購自美國Promega公司。

1.2 脂質體介導的細胞轉染(1)實驗分組：miR-501 mimic組(miR-501)和miRNA無關序列對照組(NC)；eIF4E3敲低組(eIF4E3-si)和siRNA無關序列對照組(NCi)。(2)BGC-823細胞按照3×105個/孔鋪至6孔板中，待細胞生長密度達60%～70%時，利用Lipofectamine 2000將終濃度為100 nmol/L的miR-501 mimic或siRNA eIF4E3轉入細胞，6 h后加入20%FBS。細胞轉染24 h后提取RNA，48 h后提取蛋白。

1.3 qRT-PCR檢測miR-501和eIF4E3 mRNA表達水平TRIzol試劑提取總RNA，按試劑盒說明反轉錄生成cDNA，在Agilent MX3005p上進行熒光定量PCR。U6為miR-501的內參，β-actin為eIF4E3的內參，采用2-ΔΔCt方法計算miR-501和eIF4E3 mRNA相對表達量。miR-501(Applied Biosystems公司，批號：P161011-002 H09)，U6(Applied Biosystems公司，批號：P160808-004 E06)；eIF4E3引物序列：正向引物：5′-CTGGGTCAAAGTCCAGAGGA-3′，反向引物：3′-CATAAGACCCGGTGAGCAGT-5′；β-actin引物序列：正向引物：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3′，反向引物：3′-GGAACCGCTCATTGCCAAT-5′。

1.4 Western blot檢測eIF4E3蛋白表達收集細胞提取蛋白，每組上樣40 μg，采用12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜后5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗eIF4E3(1 ∶200)孵育，4 ℃過夜，β-tubulin(1 ∶500)為內參。山羊抗兔或抗鼠熒光二抗(1 ∶16 000)37 ℃孵育1 h。Odessey紅外熒光成像儀掃膜成像。

1.5 細胞增殖活性檢測(1)CCK-8實驗：轉染細胞以3×103個/孔接種到96孔板中，分別培養1、2、3、4、5天后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育2 h后酶標儀檢測各孔450 nm處光密度值，繪制細胞增殖曲線。(2)細胞克隆形成實驗：將轉染細胞(1×103個/孔)接種到6孔板中，每2天更換新鮮培養基，14天后4%多聚甲醛固定15 min，1%結晶紫染色30 min，計數并拍照。

1.6 Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力Transwell小室侵襲實驗用無血清培養基按1 ∶4稀釋基質膠，將轉染細胞(5×104個)加入上室，下室加入600 μL含10%血清培養基，12 h后甲醇固定20 min，1%結晶紫染色30 min，100倍顯微鏡下隨機選取5個視野計數。Transwell小室遷移實驗時上室不用基質膠包被，直接將轉染細胞消化計數后加入上室。

1.7 雙熒光素酶檢測miR-501與eIF4E3的靶向關系化學合成含miR-501結合位點的eIF4E3 mRNA 3′-UTR野生型(wt)和突變型(mut)雙鏈寡核苷酸，通過XhoI-XbaI酶切位點插入pmiRGLO載體中。293T細胞(5×104個)鋪于24孔板中，過夜后利用Lipofectamine 2000轉染細胞進行實驗分組。(1)野生組：eIF4E3-wt和miR-501共轉染；(2)野生對照組：eIF4E3-wt和NC共轉染；(3)突變組：eIF4E3-mut和miR-501共轉染；(4)突變對照組：eIF4E3-mut和NC共轉染。同時轉染pRL-TK Renilla質粒作為發光內參。轉染48 h后采用Dual-Luciferase Reporter Assay System檢測細胞熒光素酶活性。每孔熒光素酶相對活性=每孔螢火蟲/Renilla(發光值)，對照組表達量化為1，野生組和突變組分別與其對照組進行比較。

1.8 生物信息學分析miR-501和eIF4E3在正常胃組織和胃癌組織中的表達利用TCGA(The cancer genome atlas)數據庫，比較miR-501和eIF4E3 mRNA在正常胃組織和胃癌組織中的表達差異。

2 結果

2.1 胃癌細胞和組織中miR-501的表達通過qRT-PCR檢測內源性miR-501在胃癌細胞系中的表達水平，結果發現胃癌細胞SGC-7901、BGC-823和MGC-803中miR-501表達水平分別是正常胃黏膜上皮細胞GES-1的2.78±0.28、2.51±0.30和1.62±0.14倍(P<0.05，圖1A)。利用TCGA數據庫比較387例胃癌組織中miR-501表達與40例正常胃組織的差異，結果發現miR-501在胃癌組織中的表達顯著高于正常胃組織(P<0.001，圖1B)，提示miR-501高表達可能與胃癌發生有關。

圖1 miR-501在胃癌細胞和組織中的表達：A.與正常胃黏膜上皮細胞GES-1比較；B.與正常胃組織比較(TCGA數據庫)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 miR-501對胃癌BGC-823細胞增殖的影響CCK-8實驗結果顯示，與陰性NC組相比，miR-501 mimic轉染的BGC-823細胞培養5天后在450 nm處的吸光度值明顯增高(23.03%±4.60%)(P<0.01，圖2A)。細胞克隆形成實驗結果顯示，miR-501組BGC-823細胞的克隆集落數為(513±41)個，高于NC組的(357±17)個(P<0.05，圖2B)，提示miR-501可增強胃癌細胞的增殖活性。

圖2 miR-501可促進BGC-823細胞增殖能力：A.CCK-8實驗；B.細胞克隆形成實驗；與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 miR-501對胃癌BGC-823細胞遷移和侵襲的影響Transwell小室遷移實驗結果顯示，轉染miR-501的BGC-823細胞穿膜數為(587±16)個，高于NC組的(396±34)個(P<0.05，圖3A)。Transwell小室侵襲實驗結果顯示，miR-501組BGC-823細胞穿膜數為(553±43)個，高于NC組的(398±21)個(P<0.05，圖3B)，提示miR-501可促進胃癌細胞的遷移和侵襲能力。

圖3 miR-501可促進BGC-823細胞遷移和侵襲能力：A.Transwell小室遷移實驗；B.Transwell小室侵襲實驗；與NC組比較，*P<0.05

2.4 miR-501與eIF4E3的靶向調控關系利用TargetScan(www.targetscan.org)數據庫預測eIF4E3 mRNA 3′-UTR區域包含有與miR-501結合的位點(AAAGGAT)(圖4A)，將包含miR-501預測結合位點的eIF4E3 mRNA 3′-UTR野生型(eIF4E3-wt)或突變型(eIF4E3-mut)寡核苷酸序列插入pmiRGLO載體，進行雙熒光素酶報告基因實驗。結果顯示：與共轉染miRNA無關序列和eIF4E3-wt相比，共轉染miR-501和eIF4E3-wt的293T細胞中，熒光素酶活性降低(44.86%±4.82%)(P<0.01)，而共轉染miR-501和eIF4E3-mut則熒光素酶活性無明顯改變(圖4B)，表明eIF4E3是miR-501的直接靶點。

圖4 miR-501可靶向調控eIF4E3：A.eIF4E3 mRNA 3′-UTR與miR-501結合位點示意圖，eIF4E3-wt為野生型，eIF4E3-mut為突變型；B.雙熒光素酶報告基因實驗，**P<0.01

2.5 miR-501對eIF4E3 mRNA和蛋白表達的影響為了進一步揭示miR-501和eIF4E3之間的調控關系，通過qRT-PCR和Western blot法檢測eIF4E3 mRNA和蛋白表達。與NC組相比，miR-501過表達可使BGC-823細胞eIF4E3 mRNA水平降低(40.78%±5.93%)(P<0.05)，與陽性對照eIF4E3-si組趨勢一致(圖5A)；BGC-823細胞轉染miR-501后eIF4E3蛋白表達也顯著減少，與eIF4E3-si組趨勢保持一致(圖5B)，表明miR-501可在轉錄后水平負調控eIF4E3表達。

圖5 miR-501可下調eIF4E3 mRNA和蛋白表達：A.qRT-PCR實驗；B.Western blot實驗；*P<0.05，**P<0.01

2.6 敲低eIF4E3對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及eIF4E3 mRNA在胃癌組織中的表達本組利用針對eIF4E3的siRNA轉染BGC-823細胞以敲低eIF4E3表達。CCK-8實驗顯示：與轉染siRNA無關序列(NCi)組相比，eIF4E3敲低可顯著增強BGC-823細胞的增殖活性，450 nm處光密度值增加了24.62%±5.34%(P<0.01，圖6A)。同時細胞克隆形成實驗顯示：eIF4E3敲低可使BGC-823細胞的克隆形成數量為(546±55)個，明顯增多；而NCi組為(357±17)個(P<0.05，圖6B)。Transwell小室遷移實驗顯示：與NCi組的穿膜細胞數(182±13)個相比，eIF4E3-si組的穿膜細胞數為(299±32個)，明顯增多(P<0.01)。Transwell小室侵襲實驗也呈相同趨勢，eIF4E3-si組的穿膜細胞數為(271±14)個，多于NCi組的(166±21)個(P<0.01，圖6C)。這些結果表明，eIF4E3敲低可促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力。通過TCGA數據庫比較eIF4E3 mRNA在415例胃癌組織和34例正常胃組織中的表達差異，結果發現eIF4E3 mRNA在正常胃組織中的表達顯著高于胃癌組織(P<0.001，圖6D)，提示eIF4E3低表達可能與胃癌發生有關。

圖6 敲低eIF4E3可促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，eIF4E3 mRNA在胃癌組織中表達降低：A.CCK-8實驗；B.細胞克隆形成實驗；C.Transwell小室實驗；D.TCGA數據庫分析eIF4E3 mRNA表達水平；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，病死率僅次于肺癌[1,7]，嚴重威脅患者健康。因此，探討胃癌發生、發展的分子機制，尋找診斷的生物學標志物和有效的治療靶點，對于改善胃癌患者預后是非常必要的。

本組前期研究發現，miR-501在子宮頸癌組織中表達增高，其高表達與子宮頸癌分化程度、原發瘤大小、FIGO分期和淋巴結轉移有關，miR-501可通過靶向下調抑癌基因CYLD，激活其下游的NF-κB p65促進子宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[8]。本文探討miR-501在胃癌細胞惡性表型中的作用及其通過靶向下調eIF4E3的表達，發揮促癌作用的分子機制。本實驗結果顯示miR-501在胃癌細胞和組織中表達明顯增高，miR-501過表達可明顯促進胃癌細胞的增殖活性以及遷移和侵襲能力。Fan等[2]報道miR-501在胃癌細胞和組織中表達上調，是胃癌患者預后差的預測因子。另有文獻報道miR-501在肝癌[9-10]、肺腺癌[11]、HNSCC組織[12]中過表達，且與肺腺癌高TNM分期相關[11]。近期有學者發現miR-501可促進結直腸癌細胞增殖和對5-FU耐藥[13]。這些研究表明miR-501可能具有促癌作用，本組結果與文獻報道一致。

目前，文獻對eIF4E3的研究較少[14-15]，其在胃癌中的作用尚不清楚。現有的研究提示其與eIF4E1不同[16]，eIF4E3可起抑癌基因作用。Borden課題組首先報道，在AML標本中eIF4E3表達顯著降低[4]；有文獻報道eIF4E3在HNSCC中表達缺失[5]；一項關于乳腺癌的研究發現，eIF4E3高表達與乳腺癌更好的生存率相關[6]。本實驗通過雙熒光素酶報告基因實驗證實eIF4E3是miR-501的直接靶點，miR-501可在轉錄后水平負調控eIF4E3蛋白表達，eIF4E3沉默可增強胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，eIF4E3 mRNA在胃癌組織中表達顯著低于正常胃組織。在AML和HNSCC中研究者發現eIF4E3表達與eIF4E1呈負相關，eIF4E3具有特殊識別m7G帽子結構的新作用機制，可抑制VEGF、c-Myc、Cyclin D1和NBS1 mRNA的表達，而這些通常是eIF4E1的下游因子，推測eIF4E3可能與具有促增殖作用的eIF4E1產生競爭，通過抑制eIF4E1功能而起到抑癌作用[4,17]。最近有文獻報道miR-1298可通過靶向eIF4E3，抑制TGF-β/Smad通路和激活Wnt通路，抑制氧化損傷[18]。

綜上所述，miR-501在胃癌細胞和組織中表達增高，miR-501可增強胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，其可能是通過靶向下調抑癌基因eIF4E3表達而實現的。因此，miR-501有望成為胃癌治療的潛在候選靶點。