GeneXpert MTB/RIF檢測在石蠟組織結核病理診斷中的應用價值

向 雙，楊杰斌，沈昌瓊，任必勇，段 松

結核病是全球范圍內大規模流行的傳染性疾病，WHO(2020)報道我國新發病例數約83.3萬，為結核病高負擔國家之一。結核病常用影像學及免疫學方法進行診斷，但影像學鑒別肺部結核及感染性疾病較為困難，而采用痰液及分泌物涂片培養等相關檢查的時效性較差。此外，臨床工作中在肺外部位也多見結核感染，肺外結核感染尚缺乏有力的診斷方法，需取活檢進行病理學確診。傳統病理診斷結核依靠于鏡下形態和抗酸染色，但抗酸染色陽性率較低[1-2]。分子生物學檢測結核菌相關研究多集中在肺、分泌物、骨組織[3]等標本類型，對病理工作中常見手術活檢樣本的研究較少。因此，本文著重探討一種準確快速的病原學檢測方法輔助組織學診斷，以期提高結核病理診斷準確性，為臨床和患者提供可靠診斷依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020年1～9月重慶大學附屬三峽醫院經病理診斷的結核病變手術標本131例，男性69例，女性62例，年齡11～86歲；平均47.7歲。按部位分為五組，肺組：29例；胸膜組：22例；頭頸組：腮腺2例、頰部1例、鼻咽喉部4例、淋巴結20例(合計27例)；骨關節組：椎體12例、髖關節2例、足踝跟部8例(合計22例)；胸腹組：乳腺7例、盆腔3例、睪丸9例、腎7例、腸道5例(合計31例)。納入標準：(1)衛健委WS 196-2017《結核病分類》中的肺及肺外結核[4]；(2)病理組織學表現符合中華人民共和國衛生行業標準(WS 288-2017)附錄C2.2條款[5]即可病理確診陽性；(3)患者入院同期進行免疫學結核感染T細胞檢測(TB-IGRA)。排除標準：樣本量<0.2 cm3。

1.2 方法選擇HE染色鏡下符合結核病變蠟塊(圖1)，標本厚5 μm連續切片15張，置于EP管中，使用QIAGEN FFPE樣本提取試劑盒，按試劑盒說明書進行脫蠟消化。切下組織標本量多時需按比例增加緩沖液和蛋白酶體積并震蕩混勻。組織體積小于0.5 cm3金屬浴56 ℃孵育2 h，大于0.5 cm3經56 ℃孵育過夜。

圖1 肉芽腫性炎伴凝固性壞死，見多核巨細胞，HE染色 圖2 肉芽腫性炎伴凝固性壞死，見多核巨細胞，抗酸染色

1.3 抗酸染色選擇HE染色鏡下符合結核病變蠟塊，切片5 μm厚，使用邁新MST-8010進行抗酸染色，具體操作步驟按試劑盒說明書，并設陽性對照(圖2)。

1.4 Xpert MTB/RIF檢測樣本消化后經90 ℃孵育1 h，取出待冷卻加入1 mL Xpert MTB/RIF配套SR試劑混勻靜置1 h。將處理好的樣本轉至試劑匣，再加入1 mL SR試劑，上機總體積為2.4 mL。試劑匣放入Cepheid GeneXpert儀器，按照SPO規程操作新建運行程序，判讀結果(圖3)。

圖3 Xpert陽性檢測：QC-1、QC-2：試劑盒質控熒光，SPC:內部質控，ProbeA-E探針依次覆蓋rpoB基因81 bp 507-533密碼子

1.5 TB-IGRA檢測131例患者在住院期間，均進行免疫學結核T細胞感染檢測(TB-IGRA)。

1.6 結果判讀抗酸染色判讀由一位主管技師和一位主治醫師采用雙盲法閱片，以降低人為主觀漏診。Xpert結果為自動判讀，由主管技師對實驗內對照和擴增曲線進行復核，降低實驗誤差。TB-IGRA結果為儀器自動判讀，由一位檢驗師進行實驗結果復核。

1.7 統計學分析以病理診斷為金標準，使用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計算各組陽性率，計數資料以“n(%)”表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。兩兩比較時采用χ2分割，a =a/c，c為比較的總次數，即c=k(k-1)/2，k為試驗組數。

2 結果

2.1 總體檢出率五組標本合計131例，三種檢測方法的總陽性率從高到低依次為：TB-IGRA檢測陽性率93.12%(122例)，Xpert檢測陽性率67.17%(88例)，抗酸染色陽性率36.64%(48例)，差異有統計學意義(P<0.01，表1)

2.2 抗酸、Xpert、TB-IGRA三種方法的比較肺、頭頸、骨關節、胸腹組中TB-IGRA、Xpert、抗酸染色兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。胸膜組TB-IGRA與抗酸染色、Xpert檢測比較，差異有統計學意義(P<0.01，表1)。此外，胸膜組其抗酸染色和Xpert檢測陽性率低于肺、頭頸、骨關節及胸腹組，Xpert檢測法與其余四組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 不同部位組織及三種檢測方法陽性率比較

2.3 TB-IGRA與結核感染部位的關系分析131例患者TB-IGRA檢測結果，所有部位均有較高陽性率，且其陽性率與結核感染部位差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 石蠟樣本結核檢出率與檢測方法的關系本實驗結果顯示：石蠟樣本Xpert檢測陽性率67.17%(88/131)，抗酸染色陽性率36.64%(48/131)。該兩種方法檢出率在肺、頭頸、骨關節、胸腹各組間，差異無統計學意義(P>0.05)，提示在不同部位活檢標本中Xpert檢測和抗酸染色的檢測能力較一致。

2.5 聯合檢測TB-IGRA陰性患者分析131例患者TB-IGRA檢測陰性者9例，采用抗酸染色檢測9例陰性患者，其中有2例陽性；經Xpert檢測9例陰性患者，其中4例陽性，但兩者差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

2019年國家八部門聯合印發《遏制結核病行動計劃(2019～2022年)》，要求最大限度發現患者，推廣方便快捷的檢測技術，提高診斷準確性。目前，結核實驗室檢查方法主要有抗酸染色、TB-IGRA、細菌培養、抗體檢測等方法。肺外結核因其感染位置深、病灶小的特點，以上方法診斷效果欠佳，臨床工作中需取組織進行病理確診[6]。此外，WS288-2017衛生行業標準也指出病理學可確診結核陽性，不足的是組織形態學對結核只能達到Ⅱ類提示性診斷報告標準[7]，因此采取一種檢測方法支撐病理報告提升到Ⅰ類明確診斷水平，對臨床患者具有重要的實際意義。

病理工作中常在形態學基礎上行抗酸染色，該染色為經典結核分枝桿菌檢查方法，具有臨床使用早、應用廣、染色快、價格便宜等優點。不足的是其對抗酸類桿菌都能陽性染色，鑒別陽性菌是否為結核分枝桿菌存在困難。本實驗及相關研究中抗酸染色陽性檢出率為30%～60%[8-9]，總陽性率較低。2010年TB-IGRA檢測被寫入美國疾病預防控制中心結核診療指南，現已逐漸成為臨床應用的免疫學方法，對肺及肺外結核的檢出率均高于抗酸和Xpert染色(P<0.01)。對于臨床癥狀明顯有既往史或影像學支持的患者，可較好地輔助診斷活動期結核，而對癥狀不明顯無其它結果支持的病例，即使TB-IGRA陽性也無法鑒別患者活動期結核或既往感染。Xpert MTB/RIF為WHO推薦結核分枝桿菌檢測方法，其設計之初標本類型僅適用于痰液，在病理診斷中應用較少。賈晨光等[10]應用骨組織檢測約34%陽性率，也有研究者將新鮮組織標本用于Xpert平臺，其檢出率高于石蠟樣本[11]，這可能與石蠟樣本DNA質量及儲存時間有關[12]。2017年Xpert MTB/RIF的升級版Xpert MTB/RIF Ultra也被WHO推薦使用，相關研究表明該平臺檢測石蠟標本的效果優于Xpert MTB/RIF，不足的是該機型在我國普及率較低，未在臨床中推廣使用。

本實驗Xpert檢測陽性率為67.17%，各組中對比抗酸染色均具有統計學意義(P<0.05)。胸膜組22例樣本中內鏡鉗取標本10例，組織直徑0.2～0.5 cm，占45.45%(10/22)。胸膜組內鏡標本抗酸陽性者，在鏡下觀察抗酸桿菌均為散在少量分布。胸膜組抗酸染色與Xpert檢出率偏低，筆者認為其原因與胸膜標本取材方式相關，取樣體積小，結核菌被取到幾率相對較低。另外，本組觀察抗酸陽性與Xpert陽性病例中，有4例為其中一種檢測陽性；這可能是因抗酸桿菌在組織病灶中分布不均，切片時的平面差異導致組織蠟塊結核菌檢出率降低。結合本實驗和實際工作，應將第1張切片行抗酸染色，切15張行Xpert檢測有助于提高檢出率。

綜上所述，在病理診斷工作中，對疑似或初診結核患者應盡早行組織標本Xpert檢查。其是一種較好的輔助手段，可同時檢測結核感染與利福平耐藥。對無法取組織的患者可送檢膿液壞死物等，以彌補TB-IGRA檢測對結核感染狀態無特異性，抗酸染色無法確認結核菌的缺點。本試驗將細菌學抗酸染色、免疫學TB-IGRA、分子生物學Xpert三種方法進行聯合分析，初步探討了應用范圍和效果，取得了較好臨床意義。不足的是因樣本量相對較少未檢出利福平耐藥的患者，對組織取樣大小與檢出率的關系尚需積累更多樣本進一步分析。