大鼠腦組織冷凍切片BrdU免疫熒光染色的經驗探討

高家樂，姚明江，張 偉，劉建勛

缺血性腦血管疾病是全球范圍內導致患者殘疾和死亡的主要原因[1]，腦缺血后可以誘發內源性的神經發生，是機體應對缺血性損傷的一種代償性保護機制。5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy Uridine,BrdU)作為DNA堿基胸腺嘧啶核苷的類似物，與胸腺嘧啶核苷相同，在細胞有絲分裂的S期摻入到增殖或分裂細胞的核內[2]，是神經發生中用來標記具有增殖活性細胞的重要指標，常與干細胞、神經祖細胞以及神經元的一些標志物共同標記，以檢測新生神經細胞的情況。側腦室下區和海馬齒狀回顆粒下區是缺血后神經發生的兩個經典位點[3]，本實驗以腦缺血大鼠為例，取含有側腦室和海馬的冠狀切面腦組織行BrdU免疫熒光染色，通過漂片法探討冷凍切片BrdU免疫熒光染色的經驗，比較是否灌注多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)、BrdU新舊抗體以及不同厚度腦片對實驗結果的影響，為科研實驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級健康SD大鼠3只，雄性，體重140～160 g，購自北京斯貝福實驗動物公司，動物合格證號：SCXK(京)2019-0010。本實驗經中國中醫科學院西苑醫院動物倫理審查委員會批準。

1.2 腦缺血模型制備和BrdU給藥實驗大鼠以400 mg/kg腹腔注射4%水合氯醛麻醉，根據文獻復制大鼠微球栓塞所致腦缺血模型[4]，從術后第一天開始腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，每天注射1次，連續7天，最后一天注射后取材。

1.3 取材和標本處理大鼠麻醉后經腹主動脈取血，然后夾閉腹主動脈上方。先經左心室灌0.9%生理鹽水至肝臟流出澄清液體，后改用4%PFA灌注至大鼠抽搐，全身僵直，即完成活體灌注固定。隨后取出大鼠完整的腦組織于4%PFA中固定2 h，將腦組織浸入25%蔗糖溶液中，待2～3天組織沉淀后直接進行冷凍切片，收集不同厚度的腦片置于0.1 mol/L PB中，用于BrdU免疫熒光染色。

對于不灌注4%PFA的大鼠，經左心室灌注0.9%生理鹽水至肝臟流出澄清液體，然后取出整腦，用模具從中間修成前后2塊，分別包含側腦室和海馬，于4%PFA中4 ℃固定過夜，然后將腦組織浸入25%蔗糖中，后續操作同上。

1.4 BrdU免疫熒光染色依據實驗需要對照《大鼠腦立體定位圖譜》(第3版)[5]，取含有側腦室和海馬的腦冠狀切面組織，厚約5 mm，在其周圍滴加OCT，冷凍后進行冷凍切片。設置4個梯度厚度的腦片，分別為25、30、35和40 μm，收集腦片依次放入含有0.1 mol/L PB的6孔板中，采用漂片法進行BrdU免疫熒光染色。

將腦片置于0.1 mol/L PB中漂洗3次，每次5 min。切片經1 mol/L HCl(37 ℃孵育30 min)變性，用0.1 mol/L硼酸鈉(pH 8.5)室溫中和10 min，再經0.1 mol/L PB漂洗3次，每次5 min。3%山羊血清室溫封閉30 min，BrdU單克隆抗體(稀釋度1 ∶500) 4 ℃孵育過夜，0.1 mol/L PB中漂洗3次，每次5 min。再將腦片置于含有DAPI的對應二抗(稀釋度1 ∶500)中，室溫避光孵育90 min，隨后于0.1 mol/L PB中避光清洗3次，每次5 min，再于0.02 mol/L PB中貼片，待切片略干但保持濕潤狀態下用抗熒光淬滅封片劑封固，并用透明指甲油將蓋玻片邊緣固封。采用Olympus熒光顯微鏡在10倍物鏡下，觀察BrdU細胞的表達。

2 結果

2.1 灌注PFA和不灌注PFA：側腦室下區和海馬齒狀回BrdU細胞的表達BrdU呈核表達，在側腦室下區和海馬齒狀回均有陽性。灌注PFA與不灌注PFA的大鼠腦片，在側腦室下區和海馬齒狀回顆粒下區均可見BrdU陽性(圖1)。同等條件下，其中不灌注PFA的大鼠腦片BrdU熒光信號更加清晰。

圖1 A.腦缺血大鼠側腦室下區BrdU呈陽性(新BrdU抗體，腦片厚40 μm)；B.腦缺血大鼠海馬齒狀回BrdU呈陽性(新BrdU抗體，腦片厚40 μm)

2.2 舊BrdU抗體：側腦室下區和海馬齒狀回BrdU細胞的表達BrdU一抗4 ℃孵育過夜，第二天回收后于4 ℃保存，使用舊的BrdU抗體進行免疫熒光染色。結果顯示：在大鼠腦組織的側腦室下區和海馬齒狀回顆粒下區BrdU均明顯陽性(圖2)，提示回收利用BrdU抗體具有可行性。

圖2 腦缺血大鼠側腦室下區和海馬齒狀回BrdU呈陽性(不灌注PFA，腦片厚40 μm)

2.3 不同厚度的腦片:側腦室下區BrdU細胞的表達腦組織冷凍切片厚25～50 μm，為尋找合適的切片厚度以增加切片數量，更好地適應實驗需求，采用25、30和35 μm的大鼠腦片進行側腦室下區BrdU免疫熒光染色。結果顯示：25、30和35 μm的腦片BrdU均呈陽性(圖3)。

圖3 腦缺血大鼠側腦室下區BrdU呈陽性(灌注PFA，新BrdU抗體)

3 討論

BrdU是神經發生中反應增殖的重要指標，雖然石蠟切片免疫陽性物易被精確定位，但切片保存的時間和溫度不當會導致組織抗原丟失，抗原反應活性降低常發生在石蠟切片上，前期實驗發現石蠟切片BrdU染色效果并不理想。冷凍切片能較完整地保存抗原的免疫活性，冷凍切片可選用漂片法和貼片法進行免疫熒光染色，漂片法是指將切好的切片直接置于裝有緩沖液的6孔板(或12孔板)中，清洗幾次后，封閉，孵育一、二抗，最后裱在載玻片上，封固后進行觀察；而貼片法需要將切好的切片，貼在載玻片上再進行下一步染色。漂片法與貼片法相比，其更能使抗體從兩側滲透，更有利于抗體與抗原充分反應，故本實驗采取冷凍切片漂片法進行BrdU免疫熒光染色。

實驗研究發現：(1)灌注PFA與不灌注PFA對BrdU熒光染色的影響：選用交聯劑PFA對動物組織進行固定，有利于保持細胞結構，但交聯會阻斷抗體的結合能力，可能降低某些組分的抗原性，特別是固定時間較長或使用較高濃度的交聯固定劑。與灌注PFA的大鼠相比，未進行PFA灌注的大鼠側腦室下區和海馬齒狀回顆粒下區均可見BrdU明顯表達，免疫熒光染色過程中切片完整，無脫片現象。(2)一抗回收對BrdU熒光染色的影響：漂片法浪費抗體，考慮到實驗成本，在BrdU一抗4 ℃孵育過夜后，第二天將其回收到干凈的離心管中置于4 ℃保存，結果顯示使用舊BrdU抗體在腦組織的側腦室下區和海馬齒狀回均有明顯表達，提示回收利用BrdU抗體的可行性，同時BrdU抗體回收利用的次數以及保存期還需要進一步分析。(3)切片厚度對BrdU熒光染色的影響：腦組織冷凍厚切片(25～50 μm)可以觀察由神經元胞體延伸而來的突觸[6]，在以上的實驗中均使用40 μm厚腦片，結果較為理想。由于側腦室和海馬所在部位的相應腦片厚度有限，為尋找合適的切片厚度以增加切片數量，更好地適應實驗需求，本實驗又探討了不同厚度的腦片對BrdU染色的影響。前期實驗表明20 μm腦片太薄，在漂洗、貼片過程中操作困難，易松散爛片，不易貼片。故本實驗選擇25、30和35 μm厚腦片進行側腦室下區的BrdU免疫熒光染色，結果顯示均有BrdU表達，其中腦片越厚，漂洗、挑片和貼片等操作相對容易，腦組織的完整性也更好。

總之，腦組織冷凍切片漂片法能較好地滿足BrdU免疫熒光染色的需求，對于冷凍切片厚度的選擇，腦組織前期處理是否灌注PFA及染色過程中BrdU回收利用的次數，可根據實驗目的和需求、經濟效益等進行綜合考慮。