中國白酒健康功能成分吡嗪類化合物研究進展

丁海龍，沈小娟，宋 川，熊燕飛*，鄧 波，敖 靈，曾 珊，李 嘉，俞 佳

（1.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；2.國家固態釀造工程技術研究中心，四川 瀘州 646000）

白酒是我國具有悠久歷史的傳統蒸餾酒，是中華民族智慧的結晶。和其他蒸餾酒相比，中國白酒的風味物質和生物活性成分含量異常豐富。據統計，截止2018年，白酒風味數據庫中的化合物已多達1 874種[1]，這些豐富的風味成分中蘊含了諸多的功能因子或生理活性物質，如吡嗪類化合物、芳香族化合物、萜烯類化合物等，能夠起到緩解酒精傷害、提升人體防御機能、調節生理節奏，以及預防疾病、促進康復等功能[1-3]。

吡嗪類化合物廣泛存在于自然中，也是在各類香型白酒中均有檢出的一類微量健康成分[4-6]，具有特殊香氣和獨特健康功能。吡嗪類化合物是中國白酒風味相關的重要化合物，它的香味閾值低，對白酒的風味有重要的貢獻，同時也是一種有益人體健康的物質，長期以來受到了研究者的極大關注。本文就中國白酒的微量健康成分吡嗪類化合物研究現狀進行分析，以期為科學認識中國白酒中的生物活性成分健康功能提供參考。

1 吡嗪類化合物介紹

1.1 吡嗪類化合物及功能

吡嗪類化合物是指苯環的1,4位含兩個氮原子的六元雜環化合物，廣泛存在于自然界和發酵食品中，具有類似于炒堅果、烤肉的怡人香氣，以及易揮發、香勢強、閾值低等特點，并以多樣的生理活性和健康功能而受到廣泛關注和重視[7-8]。許多天然食品中或食品在煮、炒、發酵過程中都能檢測出吡嗪類化合物。到目前，已累計發現120余種吡嗪類化合物，其中2-甲基吡嗪等34種吡嗪類化合物在我國已被應用于食品添加劑[9]，2,5-二甲基吡嗪等6種吡嗪類化合物已制定國家標準[10]，甲基吡嗪等5種吡嗪類化合物已制定行業標準[11]。

1.2 吡嗪類化合物的應用

吡嗪類化合物目前已廣泛應用于香料、藥物和食品添加劑行業。由于吡嗪類化合物具有特殊香氣，從20世紀60年代開始，學者對吡嗪類化合物的合成和應用進行了大量研究，2,3-二甲基吡嗪等多種吡嗪類化合物應用于香料，并成為香料中的重要系列[12]；多種吡嗪類化合物應用于醫藥領域，如天然活性成分四甲基吡嗪及其衍生物可捕捉超氧陰離子，并減少人體粒細胞的氮氧化物產生，具有重要臨床應用價值[13]。2,5-二甲基吡嗪是合成阿西莫司等新型藥物的重要中間體2-甲基-5-吡嗪甲酸的重要原料[14]，用于治療糖尿病、高脂血癥和結核病；此外，吡嗪類化合物及衍生物在農藥、電子和高分子材料中也具有重要應用價值。

1.3 吡嗪類化合物的制備

吡嗪類化合物的制備方法有直接提取法、化學合成法以及生物發酵法3種方式[15-17]。直接提取法是指在自然原料中提取。1976年，北京制藥工業研究所成功在川芎中提取川芎嗪單體[16]，但因產量得率較低無法適用于大規模工業化生產；化學合成法是吡嗪類化合物工業化生產主要方式，常用方法是利用相應的羰基、氨基化合物縮合為吡嗪環，再通過環上及側鏈取代基上的反應來制取目標化合物，具有收率高、成本低廉、可大規模制備的特點，但存在一定原料短缺和環境污染問題；生物發酵法是指以糖和氨為培養基通過微生物發酵生產目標產物[17]，因其原料來源豐富、反應條件溫和、產品綠色天然等諸多優勢，使其成為當前關注的熱點。其中，桿菌屬能在發酵過程中生產四甲基吡嗪，被認為是一類良好的吡嗪生產菌株。但由于微生物發酵產生的中間體乙偶姻量少、乙偶姻向四甲基吡嗪轉化率低，造成目標產物在微生物的發酵液中含量較低，且分離提純存在一定難度。因此，綜合利用生物工程技術、發酵工程技術以及外加前驅物質等方式，以大幅度提高發酵目標產物受到廣泛關注，并有著廣闊應用前景。

2 中國白酒中的吡嗪類化合物

2.1 白酒中吡嗪類化合物及功能

吡嗪類化合物普遍存在于白酒中[18-19]，是白酒中的主要含氮化合物，對白酒風味和健康有重要貢獻。目前，中國白酒中已檢測出吡嗪類化合物29種[2，20-21]，以烷基吡嗪類為主，主要包括四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪等。FAN W L等[6]對12種白酒樣品的吡嗪類化合物進行了檢測，研究結果表明，醬香型和濃醬兼香型白酒中吡嗪類化合物種類和含量較高，約為3 000～6 000 μg/L，含量較高的吡嗪類物質主要集中于2-乙基-6-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪等。濃香型白酒次之，其含量約為500～1 500 μg/L，個別濃香型白酒的吡嗪類化合物總量也能達到醬香型白酒的水平。吡嗪類化合物在其他香型白酒也有檢出。

2.2 白酒中四甲基吡嗪及功能

四甲基吡嗪（2,3,5,6-tetramethylpyrazine，TMP）又稱為川芎嗪，是一種重要的吡嗪類化合物。TMP天然存在于中藥材川穹根莖以及大豆、咖啡和乳制品中，目前作為常見的呈堅果味和烤面包口味的食品添加劑廣泛應用于食品、飲料、肉制品及乳制品等食品工業中[22]。除應用于食品工業外，TMP還是一種重要的治療心腦血管疾病臨床藥物成分，具有擴張血管、促進血循環、改善酒精對胃黏膜和肝臟的損傷等功能[23-24]，是中藥“速效救心丸”和西藥“川芎嗪注射液”的主要成分[25]。

在所有蒸餾酒中，四甲基吡嗪是中國白酒特有的功能性成分，近年來因其特殊的風味及明確的生物活性作用在白酒健康領域受到廣泛關注。TMP在濃香型、醬香型、清香型、芝麻香型、藥香型、兼香型、老白干香型等各類香型白酒中均有檢出，質量濃度范圍在500～6 000 μg/L之間。TMP在白酒中具有較低的風味閾值，不同酒精含量下香味識別閾值為372.11～743.39 μg/L[26]，對酒體貢獻甜香、堅果香及花香，能對其他香味物質起到明顯的烘托疊加作用，豐滿白酒的香氣。TMP對白酒風味有重要的貢獻的同時，也賦予了中國白酒有益健康的功能，楊濤等[27]經動物模型試驗研究后認為TMP具有保肝、護肝等功效，為“適量飲酒，有益健康”提供了依據。

3 白酒中吡嗪類化合物的分析檢測

作為白酒中一類重要功能物質，早在1989年，陸懋蓀等[28]開始利用陽離子樹脂富集白酒中的含氮化合物，為我國白酒中吡嗪類化合物分析檢測奠定了基礎。目前，針對白酒中吡嗪類化合物檢測方法的研究逐漸增多，氣相色譜（gas chromatography，GC）技術、液相色譜（liquid chromatography，LC）技術及氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-massspectrometry，GC-MS）技術均應用于該領域中。

3.1 氣相色譜法

氣相色譜法因具有分析靈敏度高、應用范圍廣等優點，成為目前應用最廣泛的分離檢測技術，而研究者對白酒中吡嗪類化合物的分析檢測，多是直接進樣或是采用液-液萃取、頂空固相微萃取等前處理技術，結合氣相色譜或氣相色譜-質譜分析進行。氣相色譜法檢測白酒中吡嗪類化合物的研究進展見表1。

表1 氣相色譜法檢測白酒中吡嗪類化合物研究進展Table 1 Research progress in determination of pyrazines in Baijiu by gas chromatography

續表

3.2 液相色譜法

相對于氣相色譜樣品的前處理過程繁瑣、重復性相對較差，液相色譜因不受樣品揮發度和熱穩定性的限制，從而在吡嗪類化合物的分析測定中也有諸多應用。液相色譜法檢測白酒中吡嗪類化合物的研究進展見表2。

表2 液相色譜法檢測白酒中吡嗪類化合物研究進展Table 2 Research progress in determination of pyrazines in Baijiu by liquid chromatography

4 白酒中吡嗪類化合物的生成途徑

研究認為，白酒中吡嗪類化合物主要來源于發酵過程中的微生物代謝，這體現了功能微生物在白酒釀造中的重要作用和研究價值，部分研究者認為美拉德反應也是生成途徑之一。

4.1 白酒的吡嗪類化合物的微生物合成途徑

研究證實，中國白酒中吡嗪類化合物產生的主要途徑來源于微生物的代謝反應。1962年，KOSUGE T等[37]第一次報道了枯草芽孢桿菌具有生物合成TMP的能力，并提出生物發酵液中TMP是由芽孢桿菌發酵產生的乙偶姻與氨基酸反應生成。此后微生物發酵法合成TMP的文獻報道逐漸增多。徐巖等[38]對白酒中TMP的來源及產生機制進行了深入的研究，驗證了TMP產生的主要途徑來源于微生物的代謝反應。侯孝元等[17]證實代謝反應第一階段是微生物發酵酶促反應產生前體乙偶姻，第二階段由乙偶姻與銨離子自發的熱力學反應生成TMP，這一理論目前已得到學術界的普遍接受。

4.2 白酒中吡嗪類化合物的其他生成途徑

吡嗪是許多食品的風味物質，炒堅果、咖啡、可可豆中吡嗪的形成大多通過非酶褐變中的美拉德反應產生。因此，除微生物生成途徑外，部分研究者認白酒釀造過程美拉德反應途徑也會生成吡嗪類化合物。吳建峰[39]認為，在白酒制曲過程和釀酒堆積發酵過程均會發生美拉德反應，產生的TMP經蒸餾帶入酒中。余曉等[21]認為吡嗪類化合物的生成與美拉德反應有密切關系，其含量與高溫制曲工藝密切相關。

5 白酒中吡嗪類化合物提升思路

吡嗪類化合物作為白酒中重要風味物質和健康功能成分，如何有效提升其在白酒中的含量受到廣泛關注。近年來，優良菌株選育以及基于培養基、發酵過程優化的發酵工程技術應用于釀酒生產，為吡嗪類化合物含量提升帶來了全新思路。

5.1 高產菌種選育

目前針對白酒中吡嗪類化合物的含量提升研究大多集中在高產四甲基吡嗪菌株的篩選上，篩選的菌株大多為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。沈毅等[40]篩選出兩株高產吡嗪類的地衣芽孢桿菌L8、枯草芽孢桿菌L17并應用于大曲生產，所得半成品曲坯中吡嗪類物質含量是空白組的3.85倍。王霜等[41]在兼香型白酒酒醅中篩選出兩株菌株，具有代謝產生TMP前體物質乙偶姻的能力。趙德義等[42]對高產TMP的菌株篩選獲得1株枯草芽孢桿菌功能菌株，經搖瓶培養后TMP產量達11.42 g/L；葛向陽等[43]使用強化高產四甲基吡嗪地衣芽孢桿菌的大曲，可以使濃香型原酒中TMP含量提高到3～6 mg/L，較傳統濃香型白酒提高了5～20倍；研究證實，酵母菌在厭氧環境中具有合成前體物質乙偶姻的能力。MENG W等[44]通過分子育種手段選育了2,3-丁二醇脫氫酶基因破壞的地衣芽孢桿菌BLA菌株，TMP和乙偶姻的最大產量分別增加了18.16%和17.87%，這對利用分子育種技術提高目標產物產量具有重要指導借鑒意義。

5.2 發酵工程技術

根據四甲基吡嗪微生物發酵的合成機理，代謝反應第二階段是由乙偶姻與銨離子在熱動力學作用下進行。XIAO Z J等[45]利用兩步溫度控制策略在該階段升高反應溫度至65～95 ℃，得到TMP含量為8.34 g/L的發酵液。徐巖等[38]采用優化發酵培養基成分、添加前體物質、調控發酵條件等發酵工程技術，對篩選的高產菌株培養條件進行優化，明顯提高了白酒中TMP的含量，在釀酒企業轉化應用取得了良好的效果。

6 結語

隨著現代科技的發展，前沿技術在白酒風味成分的研究得到充分應用，白酒中吡嗪類化合物不斷被發現和認識，其活性成分種類、生成機理、健康功效的面紗逐步揭開，這對于客觀科學地認識中國白酒中的生物活性成分的健康功效，促進中國白酒的科學發展、可持續發展起到了重要作用。然而，白酒中吡嗪類化合物尤其是TMP總體含量偏低，如何綜合利用微生物選育技術、發酵工程技術進一步有效提升酒體中TMP產量需要深入研究；同時，吡嗪類化合物僅是白酒中含量豐富的功能性成分的很小部分，中國白酒中諸如有機酸類、不飽和脂肪酸類、雜環類化合物和酚類化合物等有益健康的成分，以及多種成分之間的協同效用和互作機理，值得進一步研究和發掘。