三代全長高通量測序分析新稻草和陳稻草的微生物特征

張原頔，沈 毅，程 偉，薛巖松，陳小雪，韓北忠*

（1.中國農業大學 食品科學與營養工程學院 食品質量與安全北京實驗室，北京 100083；2.四川郎酒股份有限公司，四川 瀘州 510500）

高溫大曲主要作為醬香型白酒生產的糖化發酵劑，由小麥經過粉碎拌水后壓制成曲坯。由于采用生料制曲且在開放式環境中進行培菌發酵，來源于原料、水和環境的微生物在特定的溫度和濕度控制下參與大曲微生物群落的組裝和演替，從而形成高溫大曲特有的微生物群系、釀酒酶系和香味前體物質[1]。不同地區和不同生產工藝的高溫大曲中微生物群落結構存在差異，但其優勢細菌屬主要為芽孢桿菌屬（Bacillus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、泛菌屬（Pantoea）、克羅彭施泰特氏菌屬（Kroppenstedtia）和乳球菌屬（Lactococcus）等。優勢真菌主要為曲霉屬（Aspergillus）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）[2]。環境溫度較低時，霉菌大量繁殖，產生較高水平的蛋白酶。隨著培菌的進行，環境溫度升高，最高可達60～70 ℃，在此階段，耐熱細菌和嗜熱真菌占據優勢地位，發生復雜的反應生成大量代謝物[3]。

此前的研究多集中于制曲環境微生物和原料微生物，而忽略了制曲輔料微生物對大曲微生物群落的影響[4]。稻草由于其良好的保溫性能，常作為曲塊保溫的材料在培菌過程中包裹曲塊，減少曲塊在培菌過程中的熱量散失[5]。其次，稻草粘連性較強，起到了隔離曲塊、提高對大曲微生物氧氣供給的能力，同時，稻草良好的吸水和排潮性能對大曲水分含量也起到一定調節作用。稻草攜帶豐富的微生物，首次投入使用的新稻草中的微生物可以豐富大曲培菌初期微生物的種類，參與到初期復雜的菌群演替和代謝活動中；一輪發酵結束后，已使用一輪的稻草成為陳稻草，經過質量評價符合標準可重新用于新一輪的發酵，陳稻草中富集了大量培菌過程中的優勢微生物，表現出與大曲微生物相似的群落特征，再度利用可以為新一輪制曲培菌過程接種所需的菌種[5]。目前，高溫大曲實際生產過程中關于新稻草和陳稻草的選用僅依靠經驗和粗略的感官評價，針對這兩種稻草菌群差異的研究甚少。

本研究結合傳統培養法和三代全長高通量測序技術對新稻草和陳稻草的微生物菌群進行全面分析，探究兩者菌群結構和微生物代謝的差異，從微生物學的角度為制曲過程中稻草的選用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

稻草樣品：采集于中國四川某著名醬香型白酒酒企6號制曲車間，新稻草于常溫條件下存放于輔料倉庫；陳稻草采集于培菌倉，已經過一輪的高溫培菌發酵（40 d），在不同位置取三份，相同條件下粉碎裝于無菌袋，分別于4 ℃和-80 ℃保存用于后續微生物傳統培養和測序分析。

1.1.2 化學試劑

土壤基因組試劑盒：美國Bio-Tek公司；TaqDNA聚合酶（5 U/μL）：生工生物工程（上海）股份有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基、MRS培養基、孟加拉紅氯霉素瓊脂（rose bengal chloramphenicol agar，RBCA）培養基（氯霉素質量濃度為100 μg/mL）：北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

DHP-9052生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；LDZF-75L-I立式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；DYY-6C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；BG-gdsAUTO（130）凝膠成像系統：北京百晶生物技術有限公司；TGL-16B冷凍離心機：上海安亭有限責任公司。AG 223B1聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國EPPENDORF公司。

1.3 方法

1.3.1 傳統培養法

取新稻草和陳稻草粉碎樣品各5.0 g，用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，選擇合適稀釋倍數的稀釋液，每個稀釋度3個平行。總好氧性細菌總數、耐熱菌總數：采用PCA培養基分別在37 ℃和55 ℃條件下培養12～24 h[6]；乳酸菌總數：采用MRS培養基加入終質量濃度為500μg/mL的納他霉素于30℃條件下培養1～2 d[7]；真菌總數：采用RBCA培養基于30 ℃條件下培養2～3 d[8]；真菌為傾注培養，細菌均為涂布培養。

1.3.2 三代全長高通量測序分析

采用土壤基因組試劑盒提取稻草樣品微生物基因組DNA，DNA質檢合格后，以其為模板進行PCR擴增，使用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-ACCTTGTTACGACTT-3'）對稻草樣品中細菌的16S V5-V7區基因序列進行PCR擴增[9]，使用引物內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和LR3（5'-CCGTGTTTCAAGACGGG-3'）對稻草樣品中真菌的ITS區基因序列進行PCR擴增[10]，PCR擴增體系和條件參照ZHANG Y D等[11]的方法。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測，將檢驗合格的PCR擴增產物送至上海派森諾生物技術有限公司進行Pacbio SMRT測序。

1.3.3 生信分析和數據處理

原始數據通過去引物、質量過濾、去噪、拼接和去嵌合體等步驟以100%相似度聚類產生特征序列擴增子序列變異體（amplicon sequence variants，ASV），基于核糖體數據庫（ribosomal database project，RDP）網站下載的相應功能基因的seeds蛋白序列，對核酸序列中的插入和缺失錯誤進行糾正[12]。稻草細菌的16S rRNA基因在Greengenes數據庫進行分類注釋，而真菌ITS對比Unite 8數據庫。使用QIIME2（2019.4）軟件對微生物進行物種組成分析、Alpha多樣性和Beta多樣性分析，并以樹圖的形式繪制微生物分類等級樹，通過Python線性判別分析效應量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析包將非參數的Kruskal-Wallis以及Wilcoxon秩和檢驗，使用PICRUSt 2軟件預測樣本功能豐度。利用R v4.1.1進行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和Duncan檢驗計算樣品間的顯著性（P＜0.05）[13]。利用Prism 8和R studio v4.1.1進行數據可視化。

2 結果與分析

2.1 傳統培養法菌落計數

使用不同培養基對新稻草和陳稻草中可培養微生物進行菌落計數，結果見圖1。由圖1可知，兩種稻草的乳酸菌總數之間無顯著性差異（P＞0.05），陳稻草中的菌落總數、耐熱菌數和真菌總數均顯著高于新稻草（P＜0.05）。這是由于鋪于不同曲層之間的陳稻草附著了豐富的制曲培菌過程微生物，尤其是耐熱的細菌和真菌，在培菌發酵階段相較于新稻草可培養微生物數量更多。

圖1 新稻草和陳稻草中可培養微生物計數結果Fig.1 Counts results of culturable microbiota in new and used straw

2.2 微生物物種組成分析

新稻草和陳稻草中微生物群落結構見圖2。由圖2a可知，在細菌門水平，新稻草樣品中相對豐度最高的為變形菌門（Proteobacteria），平均相對豐度為65.59%，而陳稻草中相對豐度最高的是厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）相對豐度分別為50.95%和44.80%，總占比＞95%，占據了絕對優勢地位。由圖2b可知，在真菌門水平，新稻草和陳稻草的組成結構相似，子囊菌門（Ascomycota）在所有稻草樣品中的平均相對豐度均＞70%，其中在新稻草中占比略高，平均相對豐度為89.64%。

三代全長測序技術極大提升了微生物屬水平鑒定的準確度，由圖2c可知，在細菌屬水平上，由于新稻草的存放地點和陳稻草的取樣位置等的差異，同一種稻草組內的樣品平行性欠佳。總的來看，新稻草中泛菌屬（Pantoea）（11.84%）和伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）（9.31%）的平均相對豐度明顯高于陳稻草，而陳稻草中相對豐度最高的兩個細菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）（40.46%）和糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）（37.73%）。此外，陳稻草組內不同樣品之間糖多孢菌（Saccharopolyspora）的相對豐度差異較大。泛菌屬、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、孢囊桿菌屬（Cystobacter）和螺旋體屬（Spirosoma）在陳稻草中未檢出，但在新稻草中均屬于相對豐度前10的屬。兩組樣品中葡萄球菌屬（Staphylococcus）的平均相對豐度差異較小，均在6%左右。由圖2d可知，在真菌屬水平上，新稻草中的優勢真菌屬為曲霉屬（Aspergillus）（21.33%）、變形閉囊鞘屬（Chromocleista）（13.66%）和節擔菌屬（Wallemia）（1.18%），而陳稻草中Chromocleista相對豐度最高（59.42%），其次為節擔菌屬（6.49%）和曲霉屬（4.03%）。

圖2 新稻草和陳稻草在門（a，b）和屬（c，d）水平的微生物群落結構Fig.2 Microbial community structure of new and used straw at phylum (a,b) and genus (c,d) levels

綜上，新、陳稻草中微生物在細菌門水平群落結構差異明顯，而在真菌門水平則相似。兩種稻草在細菌和真菌屬水平皆差異明顯，說明制曲輔料所用的新稻草和陳稻草菌群既具有一定的共性，也存在各自的特性。ZUO Q C等[14]的研究結果表明，芽孢桿菌屬、糖多孢菌屬和根瘤菌屬（Rhizobium）是高溫大曲中的優勢菌屬，這與陳稻草中的細菌菌群結果高度相似，說明陳稻草攜帶的微生物在培菌發酵的過程中，受到溫度的調控和曲房環境微生物的影響，表現出了和大曲菌群相似的群落結構，體現了環境條件對不同來源微生物的塑造作用。DU H等[15]研究發現，泛菌屬和曲霉屬在釀造原料、車間工具和地面、新制成的大曲中的相對豐度明顯高于成熟大曲。本研究中這兩種菌屬在新稻草中的占比遠高于陳稻草，因此可以推測稻草、小麥等原輔料在生長過程中攜帶較豐富的泛菌屬和曲霉屬，在車間倉庫長期于室溫存放，但在高溫培菌發酵階段豐度有所降低。

2.3 微生物群落差異分析

為了更直觀地反映不同稻草微生物菌群的分布特征，本研究采用層級樹圖配合餅圖的形式展示樣本的分類學全貌，結果見圖3a和3b。就細菌而言，Δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、Armatimonadia、纖維粘網菌綱（Cytophagia）主要分布在新稻草中，而芽孢桿菌綱（Bacilli）、放線菌綱（Actinobacteria）則在陳稻草中的分布占比更高。就真菌而言，各個分類學水平物種在不同樣品組的分布差異明顯，散囊菌綱（Eurotiomycetes）中的不同目水平物種在兩組樣品中分布差異較大。酵母綱（Saccharomycetes）和節擔菌綱（Wallemiomycetes）主要在陳稻草中檢出，而黑粉菌綱（Ustilaginomycetes）幾乎全部存在于新稻草中。ZUO Q C等[14]研究發現，α-變形菌綱在高溫大曲培菌初期相對豐度較高，約為15%，而在培菌結束時相對豐度降至1%～2%，在本研究中，α-變形菌綱在新稻草中的相對豐度約為17%。推測新稻草對高溫大曲起到了接種α-變形菌綱的作用，而不同的稻草接種菌群有差異，這可能影響發酵初始階段大曲菌群的結構。

圖3 新稻草和陳稻草中微生物的分類等級樹圖及不同樣品組微生物非度量多維尺度分析結果Fig.3 Classification tree of microbiota in new and used straw and nonmetric multidimensional scaling analysis result of microbiota in different sample groups

此外，本研究基于Bray Curtis距離對測序獲得的ASVs進行非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）[16]分析以補充展示不同稻草細菌和真菌菌群組成的相似性和差異性，結果見圖3c和3d。NMDS采用等級排序，近似認為兩點之間的距離越近，表明兩個樣本中微生物群落的差異越小。由圖3c和3d可知，細菌和真菌NMDS分析的應力值（Stress）分別為0.000 084 6和0.014 8，遠小于0.2，因此分析結果可靠[17]。不同稻草組的樣品呈現出明顯的聚類，說明新稻草和陳稻草的細菌和真菌組成之間具有較大的差異。

2.4 物種差異與標志物種分析

采用LEfSe分析進一步分析導致兩種稻草微生物群落差異的主要物種[18]，結果見圖4。分類學分枝圖展示了樣本群落中從門到屬主要分類單元的分類等級關系，節點大小對應于該分類單元的平均相對豐度，空心節點代表組間差異不顯著的分類單元，而其他顏色的節點則表明這些分類單元體現出顯著的組間差異，且在該色所代表分組樣本中豐度較高。由圖4a可知，對于細菌，新稻草中不同分類學水平可作為生物標志物的共有1個門、3個綱、6個目、9個科和8個屬，而陳稻草中僅有1個科和1個屬可作為生物標志物。以屬水平為主進行分析，四折疊球菌屬（Quadrisphaera）、微桿菌屬（Microbacterium）、螺狀菌屬（Spirosoma）、Mucilaginibacter、橙單胞菌屬（Aurantimonas）、甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和泛菌屬在新稻草中的相對豐度均顯著高于陳稻草（P＜0.05），可作為新稻草樣品組的生物標志物，僅糖多孢菌屬在陳稻草中占比顯著高于新稻草（P＜0.05），可作為陳稻草的標志物。由圖4c可知，對于真菌，曲霉屬和孢堆黑粉菌屬（Sporisorium）更多分布在新稻草中作為其生物標志真菌屬，而變形閉囊鞘屬、念珠菌屬（Candida）、微囊菌屬（Microascus）和節擔菌屬是陳稻草中的標志真菌屬。同時，由圖4b和4d可知，線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）對數得分值均＞2，表明上述標志性物種在各樣本組中具有特異性。LEfSe分析更直接地闡明了新、陳稻草微生物群落中的代表物種，這有助于進一步在不同分類水平對不同稻草樣品組加以區分和辨別，從而表征不同稻草的微生物群落特征。

圖4 新稻草和陳稻草中差異標志物的線性判別分析效應量結果Fig.4 Linear discriminant analysis effect size results of differential markers in new and used straw

對于在新鮮稻草中豐度較高的標志物種已經有相關研究報道，如MUANGHAM S等[19]從泰國水稻葉片分離出一株內生放線菌Quadrisphaera oryzaesp.Nov，這屬于上述分析得到的新稻草中的生物標志物四折疊球菌屬的一個種，耐高溫性能較弱，因而在已經過一輪高溫發酵的陳稻草中豐度較低；此外，ZHANG H X等[20]提出，白酒發酵過程中曲霉屬由于無法很好適應發酵體系中溫度的急劇升高而逐漸被淘汰，因而曲霉屬在新鮮稻草中豐度更高。曲霉屬是發酵過程中胞外酸性蛋白酶的主要生產者，但其活性普遍受到酸、高溫等極端環境因素的抑制[21]。HU Y L等[22]研究發現，念珠菌屬（Candida）在大曲培菌后期占主導地位，這也驗證了本實驗結果中念珠菌屬在陳稻草中豐度高于新稻草，以及作為標志物種區分出陳稻草的可行性。

2.5 PICRUSt 2功能預測

使用PICRUSt 2軟件對不同稻草組樣品中的細菌和真菌的基因功能進行預測，結果發現，新稻草中細菌的總代謝通路豐度高于陳稻草，而真菌則情況相反。新、陳稻草的微生物功能代謝途徑主要集中在物質合成和分解、前體代謝物的產生以及能量生成等方面。進一步地，將通路與物種進行關聯，使用分層的樣本代謝通路豐度表進行通路的物種組成分析[23]。本研究選取了代謝通路統計結果中差異倍數較大且在發酵過程中有重要作用的通路加以說明[24]，結果見圖5。由圖5a、5b、5c可知，對于細菌，新稻草中的生物標志物腸桿菌科（Enterobacteriaceae）和泛菌屬在L-色氨酸生物合成、L-精氨酸/腐胺/4-氨基丁酸降解和甲基乙二醛降解超級途徑的占據絕對優勢，進一步解釋了發酵過程中菌群的差異會造成代謝路徑的差異，從而影響大曲最終的品質。由圖5d、5e、5f可知，對于真菌，陳稻草中的真菌標志物節擔菌屬在辛烷氧化、L-色氨酸降解為2-氨基-3-羧基粘康酸半醛和硝酸鹽還原途徑所占功能豐度明顯高于新稻草。值得注意的是，新稻草中的細菌具有更強的L-色氨酸合成功能，而陳稻草中的真菌分解L-色氨酸功能更強，因此，預測不同稻草源微生物參與到大曲發酵過程中可能造成大曲中L-色氨酸含量的差異。一些真菌如曲霉屬、青霉菌屬、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）和變形閉囊鞘屬可以通過L-色氨酸和L-脯氨酸或從L-色氨酸和L-丙氨酸合成吲哚二酮哌嗪生物堿，這種物質具有抗毒素、抗氧化和殺蟲活性[25]，同時還具有調控菌群的功能，這是使用新稻草作為輔料的突出特點之一。

圖5 涉及關鍵代謝途徑的微生物群落組成Fig.5 Microbial community composition involved in key metabolic pathways

3 結論

通過傳統培養法和三代全長高通量測序分析發現，陳稻草樣品中可培養的菌落總數、耐熱菌和真菌數量顯著高于新稻草（P＜0.05），兩種稻草的群落結構也存在明顯差異，更突出地體現在細菌群落，新稻草中豐度占優勢的細菌屬為泛菌屬和伯克霍爾德菌屬，而陳稻草中為芽孢桿菌屬和糖多孢菌屬。物種差異分析表明，四折疊球菌屬、微桿菌屬、螺狀菌屬、Mucilaginibacter、橙單胞菌屬、甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、泛菌屬、曲霉屬和Sporisorium是新稻草樣品組的生物標志物，而糖多孢菌屬、變形閉囊鞘屬、念珠菌屬、微囊菌屬和節擔菌屬可作為陳稻草的標志物。微生物的組成差異導致代謝的差異，新稻草中的細菌在L-色氨酸生物合成、L-精氨酸/腐胺/4-氨基丁酸降解和甲基乙二醛降解所占功能豐度更高，而陳稻草中的真菌在辛烷氧化、L-色氨酸降解和硝酸鹽還原途徑發揮了更重要的作用，使用新稻草作為輔料其攜帶的菌群可以在發酵過程中提供更豐富的L-色氨酸進一步合成具有調控菌群功能的生物堿類物質。本研究豐富了人們對高溫大曲制曲過程中不同稻草源微生物的認識，為稻草的選用和對大曲品質控制提供了一定的理論支撐。