低劑量酒精攝入對不同性別2型糖尿病小鼠的影響

張玉超，張智淮，劉良禹，朱思潔，楊 旭，劉旭東*

（1.茅臺學院 釀酒工程系，貴州 遵義 564507；2.茅臺學院 食品科學與工程系，貴州 遵義 564507；3.中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266100；4.華中師范大學生命科學學院，湖北 武漢 430079）

酒自從出現就與人類的社會生活密不可分，世界衛生組織（world health organization，WHO）的研究報告顯示，目前全球15歲以上的人群中約有31億的飲酒者，占15歲以上總人口的57%，飲酒人群的人均年酒精消費量為15.1 L，人均日酒精消費量32.8 g[1]。目前，飲酒對人類健康的影響，尤其是低劑量飲酒對健康的影響，正逐漸受到社會各界的關注。

2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）被認為是一種嚴重威脅人類健康的世界性公共衛生問題，很多環境和生活因素都被認為具有誘發、加重T2DM的風險[2-3]，流行病學調查研究表明，飲酒和T2DM的發生、發展有一定的聯系[4-6]。有研究結果顯示，任何劑量的酒精攝入都會增加男性T2DM的患病風險；但對于女性在日酒精攝入量低于10 g的情況下反而可降低T2DM的患病風險，高于10 g則會增加患病風險[7]，說明低劑量酒精攝入對T2DM的影響可能存在著性別差異。

為進一步了解低劑量酒精攝入對T2DM的影響是否存在性別差異及可能機制，本研究以人體日酒精攝入量10 g作為低劑量酒精攝入標準，對T2DM雌、雄小鼠連續灌胃30 d，對各組小鼠的糖脂代謝相關指標進行檢測，并對小鼠胰腺組織病理學損傷和氧化應激水平進行分析，以期為進一步闡明低劑量飲酒對T2DM的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級昆明小鼠：6～8周齡，體質量（20±2）g，購自于湖北省實驗動物研究中心，飼養于SPF級實驗動物房中，小鼠置于無病原專用鼠籠內，每天12 h光照和12 h黑暗，允許自由進食和飲水。動物飼養室內溫度控制在20～25 ℃，室內相對濕度為50%～70%，保持室內安靜，避免強光照。

基礎飼料：湖北省實驗動物研究中心；高脂高糖飼料：上海集奇生物科技有限公司；二甲雙胍片（500 mg/片）：浙江亞太藥業股份有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2',7'-dichlordihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）：美國Sigma-Aldrich公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒、胰島素酶聯免疫分析試劑盒：南京建成生物工程研究所；葡萄糖激酶（glucokinase，GK）活性、肝糖原檢測試劑盒：上海僑杜生物科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒、干擾素γ（interferon-γ，INF-γ）檢測試劑盒：美國eBioscience公司；胰島素免疫組化試劑盒：南京爍樸生物科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

590血糖儀及試紙：江蘇魚躍醫療設備有限公司；ELx800酶標儀：美國Bio-Tek公司；Hide Chameleon V多功能熒光酶標儀：芬蘭Hidex公司；5424R低溫冷凍離心機：德國Eppendorf公司；DP73顯微鏡：日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 T2DM模型的構建[8-9]

首先采用基礎飼料對小鼠進行一周適應性飼養。一周后，隨機選取40只小鼠（雌雄各20只）全程采用基礎飼料飼養，其他小鼠全程采用高脂高糖飼料進行飼養。采用STZ對高脂高糖飼料喂養小鼠進行處理，構建T2DM模型：小鼠經高脂高糖飼料喂養4周后，首次進行STZ（50 mg/kg）腹腔注射，注射前12 h小鼠禁食不禁水。隨后每3天注射一次STZ，全過程小鼠共注射3次STZ，除每次注射前12 h進行禁食外，其他時段小鼠均自由進食進水。3次STZ注射完成一周后，對小鼠進行12 h禁食，隨后采用尾靜脈取血方式取血樣，測定小鼠的空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），以FBG＞11.1 mol/L視為建模成功。隨機選取建模成功的雌雄小鼠各60只進行后續實驗。

1.3.2 實驗動物分組及酒精暴露

將實驗動物按表1分為10組進行相應的處理，以1個酒精單位，即10 g純酒精/天，作為低劑量酒精攝入標準[7]，對人群暴露劑量與小鼠暴露劑量進行等效換算[10]，得出本實驗中小鼠酒精的灌胃暴露劑量為0.033 mL/d。陽性對照組二甲雙胍給藥劑量為200 mg/（kg·d）[11]，連續灌胃周期為30 d。

表1 實驗小鼠分組與處理Table 1 Grouping and treatment of mice

1.3.3 小鼠體質量增長量的測定

小鼠在酒精灌胃暴露第1天稱體質量，記為初始體質量，在最后一次酒精灌胃暴露后，對小鼠進行禁食不禁水12 h后稱體質量，記為終體質量，計算小鼠體質量增長量，其計算公式如下：

1.3.4 小鼠血清相關指標的測定

在最后一次酒精灌胃暴露后，對小鼠進行禁食不禁水12 h，隨后對小鼠進行斷尾取血，使用血糖儀檢測小鼠FBG。最后一次酒精灌胃暴露后，對小鼠進行禁食不禁水12 h，所有小鼠均按2.00 g/kg劑量灌胃葡萄糖溶液，分別于葡萄糖灌胃后0 h、0.5 h、1.0 h和2.0 h對小鼠進行斷尾取血測定血糖水平，計算血糖曲線下面積（area under the curve of blood glucose，AUC）[12]。參照試劑盒說明書測定小鼠血清中的TC、TG、LDL-C、HDL-C及胰島素含量。

1.3.5 小鼠肝臟和胰腺組織樣品的制備

最后一次酒精暴露結束24 h后，用頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠胰腺組織和肝組織。每組隨機選擇3只小鼠胰腺組織置于4%的多聚甲醛中進行固定，制作組織切片，其余胰腺組織及肝組織制備組織勻漿。將所取組織置于冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH=7.5）中洗凈，用吸水紙吸干水分，然后放至玻璃勻漿器中，加入冷的磷酸鹽緩沖液制成10%的組織勻漿，然后在4℃下以10000r/min離心10 min，將上清分裝置于-80 ℃冰箱待使用。

1.3.6 小鼠胰腺組織中胰島損傷的觀察及胰島素表達情況

對小鼠胰腺組織進行石蠟包埋和切片后，進行蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，H&E）染色[13]，隨后在顯微鏡下進行切片觀察。按照試劑盒說明對小鼠胰腺組織進行胰島素免疫組化（immunohistochemistry，HIS）染色，隨后在顯微鏡下進行切片觀察，對HIS染色切片隨機選擇5個陽性視野區域，使用IPP 6.0軟件測定每張胰島素HIS切片陽性區域顯色深淺，以平均光密度（optical density，OD）值來衡量，并進行定量分析[14-15]。

1.3.7 小鼠肝臟組織及胰腺組織相關指標的測定

采用Lowry法測定組織勻漿中的蛋白質含量[16]。按照試劑盒說明書檢測小鼠肝臟組織勻漿上清液中的GK活性及肝糖原含量。采用磷酸鹽緩沖液將小鼠胰腺組織勻漿上清液稀釋10倍，采用DCFH-DA法檢測活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）相對表達量，使用相對熒光強度進行衡量[17]。使用TBA法測定小鼠胰腺組織勻漿上清液中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量[18]。按試劑盒說明書測定小鼠胰腺組織勻漿上清液中的GSH、TNF-α和INF-γ含量及SOD活性。

1.3.8 數據處理

采用SPSS 13.0分析數據，使用GraphPad Prism 8.0生成數據統計圖，使用t檢驗分析差異性，P＜0.05表示兩組之間具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 雌雄小鼠糖脂代謝相關指標變化情況

雌、雄小鼠糖脂代謝相關指標的變化分別見表2和表3。

表2 雌性小鼠糖脂代謝相關指標的變化Table 2 Changes of glucose and lipid metabolism related indexes in female mice

表3 雄性小鼠糖脂代謝相關指標的變化Table 3 Changes of glucose and lipid metabolism related indexes in male mice

由表2及表3可知，與CK組小鼠相比，建模后T2DM雌、雄小鼠的FBG顯著升高（P＜0.05），GK活性、肝糖原含量和體質量增長量顯著下降（P＜0.05），TC、TG、LDL-C含量顯著升高（P＜0.05），而HDL-C含量顯著下降（P＜0.05），說明T2DM模型構建成功。與T2DM小鼠相比，陽性對照組小鼠相關指標改變情況得到了顯著的緩解（P＜0.05），FBG也已下降至建模標準以下，同時，陽性組雌性小鼠的TC、LDL-C和肝糖原含量、GK活性，以及陽性組雄性小鼠的TC、TG和HDL-C含量均已恢復至CK組水平。

連續30 d攝入低劑量酒精后，CK組小鼠并未出現顯著性改變（P＞0.05），但T2DM小鼠糖脂代謝相關指標的變化情況出現了差異。低劑量酒精攝入進一步加重了T2DM雄性小鼠糖脂代謝相關指標的紊亂情況；但對T2DM雌性小鼠影響較小，僅TC及肝糖原含量出現了一定程度的改變（P＜0.05）。說明低劑量的酒精攝入可以加重T2DM雄性小鼠糖脂代謝紊亂情況，T2DM癥狀加劇。

2.2 小鼠胰腺組織的病理學觀察及胰島素表達情況

小鼠胰腺組織切片H&E染色結果見圖1。

圖1 小鼠胰腺組織病理學觀察Fig.1 Histopathological observation of pancreatic tissue of mice

由圖1可知，CK組小鼠胰腺組織切片中胰島的形狀規則，呈圓形或橢圓形，胰島邊緣清晰，胰島中細胞分布均勻，胰島外周漿液性腺泡胞漿豐富，排列整齊。而T2DM小鼠胰島出現了不同程度的萎縮，邊緣不整，胰島中央細胞稀疏、分布不均勻。陽性對照小鼠與T2DM小鼠相比，胰島損傷有明顯改善，但胰島仍然存在一定萎縮和邊緣不整的情況。低劑量酒精攝入后，CK組小鼠胰腺組織中的胰島并未出現明顯的病理學損傷，同時T2DM雌性小鼠胰島損傷也未進一步加重，但T2DM雄性小鼠胰島進一步萎縮，胰島中央細胞更加稀疏。說明低劑量酒精攝入對T2DM雌性小鼠胰島損傷并無影響，但進一步加重了T2DM雄性小鼠胰島損傷。

對小鼠胰腺組織切片進行胰島素HIS染色，結果見圖2，小鼠胰島素HIS染色的平均OD值及含量見圖3。

圖2 小鼠胰腺組織的胰島素免疫組化染色結果Fig.2 Insulin immunohistochemical staining results of pancreatic tissue of mice

圖3 小鼠胰島素免疫組化染色的平均OD值及含量Fig.3 Average OD value and content of insulin immunohistochemical staining of mice

由圖2和圖3可知，各組小鼠胰腺組織均有胰島素的表達。與CK組相比，T2DM小鼠胰島素HIS染色的平均OD值均顯著下降（P＜0.05），而與T2DM小鼠相比，陽性對照組小鼠胰島素HIS染色的平均OD值顯著升高（P＜0.05），且陽性對照組雌性小鼠胰島素HIS染色的平均OD值已恢復至CK組水平（P＞0.05），但陽性對照雄性小鼠胰島素HIS染色的平均OD值顯著低于CK組（P＜0.05）。同時，低劑量酒精的攝入并未顯著改變CK組小鼠以及T2DM雌性小鼠胰島素HIS染色的平均OD值（P＞0.05），但是進一步的降低了T2DM雄性小鼠胰島素HIS染色的平均OD值（P＜0.05）。由圖3可知，小鼠血液中胰島素水平變化情況與胰腺組織切片胰島素HIS染色的平均OD值變化情況類似。說明低劑量的酒精攝入對T2DM雌性小鼠胰腺組織和血液中胰島素水平均無顯著性影響，但能進一步降低T2DM雄性小鼠胰腺組織和血液中胰島素的表達水平。

2.3 小鼠胰腺組織氧化應激水平變化情況

氧化應激是機體內氧化和抗氧化平衡紊亂導致的一種功能失調狀態，是引起機體細胞損傷、死亡的重要機制之一，與T2DM的發生和發展有密切的聯系[19-21]。細胞內ROS的過量積累會導致生物大分子的損傷[22-23]，持續高水平的ROS會進一步促進炎癥因子的產生，誘導炎癥反應的發生[24-25]。小鼠胰腺組織氧化應激水平的變化見表4和表5。

表4 雌性小鼠胰腺組織氧化應激水平的變化Table 4 Changes of oxidative stress level of pancreatic tissue of female mice

表5 雄性小鼠胰腺組織氧化應激水平的變化Table 5 Changes of oxidative stress level of pancreatic tissue of male mice

由表4及表5可知，與CK組相比，T2DM小鼠胰腺組織ROS表達量、脂質過氧化物MDA和炎癥因子TNF-α、INF-γ的表達量均顯著升高（P＜0.05），而還原性氨基酸GSH含量和抗氧化酶SOD活性顯著下降（P＜0.05），說明T2DM小鼠胰腺組織氧化應激水平顯著升高，部分炎癥因子表達量也在增大。陽性對照組小鼠與T2DM小鼠相比，相關指標改變情況出現了顯著性的緩解，陽性對照組雌性小鼠MDA、TNF-α、INF-γ表達量及SOD活性，以及陽性對照雄性小鼠TNF-α、INF-γ表達量均已恢復至CK組水平。

連續30 d攝入低劑量酒精后，CK組小鼠并未出現顯著性改變（P＞0.05），但T2DM小鼠氧化應激指標的變化情況出現了差異。低劑量酒精攝入后，T2DM雌性小鼠胰腺組織只有GSH水平出現了一定的上升（P＜0.05），其他指標均未發生變化（P＞0.05）；而T2DM雄性小鼠胰腺組織ROS、MDA、TNF-α的表達量進一步升高（P＞0.05），GSH表達量進一步下降（P＞0.05）。說明低劑量酒精攝入進一步加劇了T2DM雄性小鼠胰腺組織氧化應激，對T2DM雌性小鼠胰腺組織氧化應激水平并未產生顯著性的影響。

3 結論

采用鏈脲佐菌素（STZ）處理高脂高糖飼料喂養的小鼠構建T2DM模型，以灌胃200 mg/（kg·d）二甲雙胍的T2DM小鼠為陽性對照，連續灌胃低劑量酒精（0.033 mL/d）30 d后，T2DM雄性小鼠的糖脂代謝紊亂情況及胰腺組織中胰島損傷情況加重，胰島素表達量降低，T2DM雄性小鼠胰腺組織氧化應激水平上調，但T2DM雌性小鼠未產生顯著影響，推測胰腺組織氧化應激水平的差異性影響可能是低劑量酒精對不同性別T2DM小鼠產生差異影響的主要機制之一。后續研究中，可通過分析不同劑量酒精對T2DM雌雄小鼠氧化應激信號通路關鍵分子的作用，進一步揭示低劑量酒精對T2DM產生性別差異性影響的分子機制，為闡明低劑量飲酒對T2DM的影響提供參考。